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图3.11 酶添加量木瓜蛋白酶的对水解度和固形物含量的影响
Fig. 3.11 The impact of papain content on the degree of hydrolysis and solids content
由图3.11可知，酶添加量在1.0%-2.0%之间，随着加酶量的增加，水解度迅速上升，超过2.0%时，水解度的上升明显减缓。产生以上结果的原因可能是在酶解反应中，随着加酶量的增加，过量的木瓜蛋白酶分子抑制了中间产物向酶解反应的终产物的转化，开始时牛骨粉底物较充足，一方面，酶量的增加增多了其与底物接触的机会，从而增强水解程度，使水解度和总氮回收率都呈上升趋势；另一方面，当加入的蛋白酶已饱和底物时，酶量的增加主要使肽生成小肽和氨基酸，并不明显增加总氮回收率。当蛋白酶浓度过大时，由于其本身也是蛋白酶而发生酶解，反而干扰了酶解物的组成。
试验中，加酶量到达2.0%时，水解度最大，而继续添加酶量时，趋于不明显的上升或平稳趋势。综合考虑试验指标与生产成本，认为木瓜蛋白酶加酶量取在2.0% 较为合适。
（2）木瓜蛋白酶酶解时间的选择
首先先添加猪胰脂肪酶，条件为温度35℃，pH7，底物浓度1:6，酶添加量为1.5%的情况下酶解3h。随后，为了确定木瓜蛋白酶的最适添加量，在温度60℃，pH为7.0，底物浓度为1:8，酶添加量是2.0%的情况下分别酶解1、2、3、4、5h，观察不同木瓜蛋白酶酶解时间对酶水解效果的影响，结果见图3.12（origin作图）。
图3.12 酶解时间对木瓜蛋白酶的水解度和固形物含量的影响
Fig. 3.12 The impact of the hydrolysis time on the degree of hydrolysis and solids content
当其他条件一定时，酶解反应随着时间的增长而逐渐加深。如图3.12所示，酶解时间为3小时时，水解度最高。而固形物含量整体变化不明显，这是因为牛骨含量基本相同，所以酶解液组成也基本相似，所以固形物含量变化不大。
随着水解时间的延长，木瓜蛋白酶与底物作用充分，水解度逐渐增加，当达到3h后水解度变化逐渐下降。随着时间的继续增加，底物浓度减少，从而导致水解速度降低。酶解反应的初速度最快，但随着反应混合物中底物浓度的变小、溶解性肽的逐渐增加，这些反应产物与未水解的牛骨粉对酶产生竞争性结合，使溶解氮产生的速度减缓，即蛋白质分子水解不是均匀的。理论上图的变化应该随着时间的增长而趋于平缓，而实际情况中通常会出现下降趋势，其原因可能是：随着水解时间的增长，底物的损耗增大（包括粘在瓶壁上的底物、酶解过程挥发出来的水分等），导致最后离心出来的酶解液体积偏小，从而影响其水解度。此外，酶也可能因为自降解而失活，使酶自身的活力逐渐衰弱。而且在工厂大批量生产时，若酶解时间过长也十分的不经济，因此，综合利弊得出酶解时间2h为最适酶解条件。
3.2.2 复合蛋白酶与风蛋白酶复配使用酶解牛骨粉的优化
（1）复合蛋白酶添加量的选择
首先先添加猪胰脂肪酶，条件为温度35℃，pH7，底物浓度1:6，酶添加量为1.5%的情况下酶解3h。随后，为了确定复合蛋白酶的最适添加量，在温度55℃，pH为7.5，底物浓度为1:8，酶添加量分别是0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的情况下酶解3h，然后继续加入风蛋白酶（条件为温度50℃，酶解时间2h），观察不同复合蛋白酶酶添加量对酶水解效果的影响，结果见图3.13（origin作图）。
图3.13 酶添加量对复合蛋白酶的水解度和固形物含量的影响
Fig. 3.13 The impact of the protamex content on the degree of hydrolysis and solids content
图3.13描述了水解度随复合蛋白酶添加量的变化趋势，酶添加量在1.0%-2.0%之间时，水解度快速上升，此后再增加酶的添加量水解度变化很小。这可以解释为在低水平的酶添加量条件下，底物浓度偏低，酶被底物所饱和，因此随着酶添加量的增加水解度迅速增加，当酶添加量达到2.0%后变化幅度放缓，可能是酶与酶之间产生了竞争性抑制作用，导致尽管酶量成倍增加，但水解度却仅有少量的上升。