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试验中，加酶量到达1.5%时，水解度最大，而继续添加酶量时，水解度呈现下降趋势，理论上应该趋于不明显的上升或平稳趋势，而实际试验中，由于各种误差或者是操作不当等原因导致加酶量增加时水解度略微的下降。综合考虑试验指标与生产成本，认为一鸣脂肪酶加酶量取在1.5% 较为合适。
（4）底物浓度的确定
为了确定合适的底物浓度，在温度45℃，pH7.5，底物浓度分别为1:4、1:6、1:8、1:10、1:12，酶添加量为1.5%的情况下酶解3h，之后，加入适量的木瓜蛋白酶（温度为60℃，加酶量为1.5%，pH为7）进行蛋白酶解，3h后观察不同底物浓度对酶水解效果的影响，结果见图3.9（origin作图）。
图3.9 底物浓度对水解度和固形物含量的影响
Fig. 3.9 The impact of substrate concentration on the degree of hydrolysis and solids content
由图3.9可知，当底物浓度在1:4-1:8之间时，水解度呈快速上升趋势，超过1:8时水解度开始有所下降。这是由于反应速率取决于底物浓度。此次试验中因为底物浓度不同，稀释程度也就不同。稀释度越大，固形物含量越小。当底物浓度高于1:8时，随着底物浓度的继续增大，由于酶和底物的中间产物增多，限制了最终酶解产物的生成，所以导致了水解度的下降。综上所述，底物浓度选择1:8最合适。
（5）一鸣脂肪酶的酶解时间的确定
为了研究一鸣脂肪酶的酶解时间对水解度和固形物含量的影响，在温度45℃，pH7.5，底物浓度为1:8，酶添加量为1.5%的情况下分别酶解1、2、3、4、5个小时，之后，加入适量的木瓜蛋白酶（温度为60℃，加酶量为1.5%，pH为7）进行蛋白酶解，3h后观察不同酶解时间对一鸣脂肪酶的水解效果的影响，结果见图3.10（origin作图）。
图3.10 酶解时间对一鸣脂肪酶的水解度和固形物含量的影响
Fig. 3.10 The impact of the hydrolysis time on the degree of hydrolysis and solids content
当其他条件一定时，酶解反应随着时间的增长而逐渐加深。如图3.10所示，酶解时间为3小时时，固形物含量较低，且水解度最高，误差较小。
随着水解时间的延长，一鸣脂肪酶与底物作用充分，水解度逐渐增加，当达到3h后水解度变化逐渐下降。随着时间的继续增加，底物浓度减少，从而导致水解速度降低。酶解反应的初速度最快，但随着反应混合物中底物浓度的变小、溶解性肽的逐渐增加，这些反应产物与未水解的牛骨粉对酶产生竞争性结合，使溶解氮产生的速度减缓，即蛋白质分子水解不是均匀的。理论上图的变化应该随着时间的增长而趋于平缓，而实际情况中通常会出现下降趋势，其原因可能是：随着水解时间的增长，底物的损耗增大（包括粘在瓶壁上的底物、酶解过程挥发出来的水分等），导致最后离心出来的酶解液体积偏小，从而影响其水解度。此外，酶也可能因为自降解而失活，使酶自身的活力逐渐衰弱。而且在工厂大批量生产时，若酶解时间过长也十分的不经济，因此，综合利弊得出酶解时间3h为最适酶解条件。
3.2 酶解牛骨粉对蛋白酶的选择
上述试验中得出猪胰脂肪酶的水解度整体较一鸣脂肪酶的水解度大，故本次试验选用猪胰脂肪酶。固定猪胰脂肪酶各条件不变，优化木瓜蛋白酶和复合蛋白酶及风蛋白酶的酶解条件。
3.2.1 木瓜蛋白酶酶解牛骨粉的优化
（1）木瓜蛋白酶加酶量的选择
首先先添加猪胰脂肪酶，条件为温度35℃，pH7，底物浓度1:6，酶添加量为1.5%的情况下酶解3h。随后，为了确定木瓜蛋白酶的最适添加量，在温度60℃，pH为7.0，底物浓度为1:8，酶添加量分别是1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的情况下酶解3h，观察不同木瓜蛋白酶酶添加量对酶水解效果的影响，结果见图3.11（origin作图）。