glgB/GASBD融合基因在马铃薯中的表达对淀粉分支程度的影响(3)

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对转基因淀粉中glgB-GASBD或GASBD-glgB融合蛋白的积累量用Western斑点杂交方法进行分析。首先取20mg转基因淀粉，加入200μL 2×SDS样品缓冲液，煮沸5分钟，然后待温度降至室温后，最后用Mini Trans-Blot System (Bio-Rad，美国) 将转基因淀粉凝胶中的glgB-GASBD或GASBD-glgB蛋白印迹转移到硝酸纤维素膜上(Milliper公司，美国)。电转移条件是：200mA，4℃，120min。将转印后的硝酸纤维素膜置于80mL封闭液中[80mL TTBS缓冲液(TBS+ 0.05% Tween-20)+5%脱脂奶粉+0.1% BSA]，室温下封闭过夜，然后用10mL TTBS缓冲液洗膜4次，每次10min，接下来适当的加入用TBS(20mMTriss-HCl，500mMNaCl，pH7.5)缓冲液1：500稀释的一抗Anti-GASBD，室温下温育2h，接着用TTBS缓冲液洗膜3次(每次5min)后，加入用TBS缓冲液1：500稀释的二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，IgG-HRP，KeyGEN，南京)，室温下温育2h。最后用TBS缓冲液清洗3次，每次5min。最后用显色液(10mL 0.05M Tris-HCl，0.01mL 30% H2O2，6mg 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸，pH 7.6)显色2-3min。注意在实验过程中每个样品重复检测3次。