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摘要：以pTrcHisB-GASBD2质粒DNA为模板，扩增出BglII-Linker-GASBD-BamHI片段，然后将此片段插入到pTrcHisB-GASBD2质粒的BglII酶切位点中，即得到重组质粒pTrcHisB-GASBD3。pTrcHisB-GASBD4质粒的构建采用相同的方法进行。用BamHI酶和HindIII酶分别双酶切pTrcHisB-GASBD3和pTrcHisB-GASBD4重组质粒，并将BamHI-HindIII GASBDs小片段插入到pET28a质粒的对应酶切位点中，即得到重组质粒pET28a-GASBD3和 pET28a-GASBD4。57493
毕业论文关键词：GASBD，载体构建，pET28a-GASBD3，pET28a-GASBD4
Abstract: The BglII-Linker-GASBD-BamHI fragments was amplified by PCR using pTrcHisB-GASBD2 plasmid DNA as a template, and then inserted into cloning vector pTrcHisB-GASBD2 plasmid to generate recombinant plasmid pTrcHisB-GASBD3. pTrcHisB- GASBD4 plasmid was constructed using the same method. The BamHI-HindIII-GASBDs fragments of pTrcHisB-GASBD3 and pTrcHisB-GASBD4 were, respectively, inserted into the corresponding restriction sites of pET28a plasmid to get two recombinant plasmids pET28a-GASBD3 and pET28a-GASBD4.
Keywords：GASBD ，vector construction，pET28a-GASBD3，pET28a-GASBD4
目 录
1前言 4
2 实验材料 5
2.1 菌株与质粒 5
2.2主要购买试剂 5
2.3主要仪器设备 5
2.4自制试剂 5
3 实验方法 5
3.1 pTrcHisB-GASBD3质粒的构建 5
3.1.1 pTrcHisB-GASBD2 DNA质粒的提取 5
3.1.2 BglII- Linker –GASBD-BamHI片段的扩增 6
3.1.3 PCR产物的纯化、酶切与回收 6
3.1.4 pTrcHisB-GASBD2质粒的DNA单酶切 6
3.1.5 重组质粒pTrcHisB-GASBD3的构建 7
3.1.6 阳性克隆的筛选和鉴定 7
3.2 pTrcHisB-GASBD4质粒的构建 8
3.3 pET28a-GASBD3和 pET28a-GASBD4质粒的构建 8
4 结果与分析 8
4.1 pTrcHisB-GASBD3质粒的构建 8
4.2 pTrcHisB-GASBD4质粒的构建 9
4.3 pET28a-GASBD3和pET28a-GASBD4质粒的构建 10
结 论 12
参考文献 13
致 谢 14
1前言
一些具有多结构域的微生物淀粉酶具有生淀粉结合能力，其中的一个结构域称为淀粉结合结构域(starch-binding domain, SBD) [1]，它的功能是加速淀粉酶与淀粉粒表面结合能力，增加淀粉粒表面酶的浓度，从而可以加速淀粉粒的水解速度[2]。到2014年为止,具有这些功能的家族有：CBM20、CBM21、CBM25、CBM26、CBM34、CBM41、CBM45、CBM48、CBM53、CBM58和CBM69,其中CBM69是2014才被确立的新家族。
CBM20家族SBD的氨基酸是100个左右并且具有很好的保守性。黑曲霉糖化酶SBD（属于CBM20家族）的三维结构是第一个被确定的，是SBD结构的代表。在此结构域中含有8条β链，而且形成了两个重要的β折叠片[3]。其中5条反向平行的β链组成了第一个β折叠片，而由1条平行β链和1对反向平行β链组成第二个β折叠片。由于C-末端和N-末端分别位于SBD分子长轴两端，所以形成了一种开放、扭曲的β-折叠桶结构，并在N-末端与第7、第8两条链形成的环之间形成了一个二硫键[3]。在黑曲霉糖化酶SBD的结构上，可以明显的发现有两个独立的结合位点，分别存在于SBD的两端，每一个位点上面都会存在着两个或三个裸露的芳香族氨基酸，不过这两个结合位点在结构和功能上还是有很大差异的[4]。结合位点1易于接近且比较小，它主要对淀粉识别和结合起到明显的作用，同时可以使结合位点2的结构发生改变，使其更加稳定的与淀粉的第二条链相结合。结合位点2则与1不同，显得较大，不过结合位点2更具有延伸性和灵敏性。