HDAC1表达载体的构建及其鉴定(2)

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大脑的结构和功能可塑性是以神经元的活动为基础，神经元的适应性反应参与记忆形成和储存，包括突触功能和结构上的改变，这都是通过调节基因表达来完成[7]。基因表达需要多层次的转录调控，通过转录调节因子，结合特定的DNA序列，导致染色质结构的改变，从而控制DNA调控因子的可访问性[8]。近年来，神经退行性疾病在人群中发病率越来越高，如阿兹海默症（AD）、亨丁顿舞蹈症（PD）等，这类疾病主要表现为大脑特定区域进行性神经元丢失等特征。现阶段已有研究结果表明，组蛋白乙酰化修饰在神经发育过程中发挥着重要作用，参与了神经干细胞的增殖、分化等多个过程，参与了神经干细胞产生新神经元的过程，对脑内神经元的生长和数量维持发挥了决定性作用[9]。而在组蛋白去乙酰化酶（HDAC）庞大的基因家族中，HDAC1在神经干细胞（祖细胞）和神经胶质细胞中均有较高的表达[10]，其在多能干细胞向神经干细胞以及前体细胞向成熟神经元的转变中也起着重要的调节作用。因此，构建HDAC1的表达质粒，将有助于研究HDAC1对神经元结构和功能的调控机制。

第二章前期准备

2.1材料

MgCl2、CaCl2、甘油（上海生工生物技术有限公司）E.coli Top10菌株(-80°C冻存)；绒促性素（HCG）（宁波第二激素厂）；

仪器：

离心机（BECKMAN COULER Avanti J-26 XP）；超净工作台（上海博讯 SW-CJ-2FD）

自配试剂:

10X Steinberg’s Stock：119g Hepes，34g Nacl，2.06g magnesium sulfate， o.8g calcium nitrate，0.5g potassium chloride，1liter water pH7.5

LB固体培养基（1L）

Trptone 10g

高压灭菌，冷却至50-60°C是到平板，4°C放置备用

Yeast Extract 5g

Nacl 10g

Agar 15g

LB液体培养基(1L)

Trptone 10g

高压灭菌后4°C放置备用

Yeast Extract 5g

Nacl 10g

2.2动物饲养

成年非洲爪蟾购自美国NASCO公司。雌雄成年爪蟾饲养于含有去氯自来水的爪蟾养殖系统内，水温(22±2)℃，明暗光照周期为12h:12h，每周二喂1次猪心和1次合成饲料。给非洲爪蟾注射人绒毛膜促性腺激素（HCG）诱导产卵，雌性600-700IU，雄性300-400IU，放入同一孵化缸中，产卵完毕后，移出成体蛙. 受精卵在(22±2)℃的去氯自来水中孵化。蝌蚪孵化1天后，转移至培养液中。待蝌蚪长到46-47期时进行下一步实验。

2.3新鲜感受态制备：

取少量菌液（E. coli Top10）在无抗性的LB培养基上进行划线，于37°C培养箱中培养过夜。从LB固体培养基上挑取E. coli Top10单菌落，接种到5-7ml LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养至对数生长后期，约12小时左右。将浑浊菌液以1:50-1:100的比例接种至100ml LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养3小时左右，OD600值在0.3-0.4之间。

将浑浊菌液液转入预冷的离心管中，冰上静置10分钟后于4℃离心10分钟，5000rpm。弃上清，加入10ml预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液，用涡旋仪振荡使菌株悬浮，冰上放置3分钟后，4℃离心10分钟，5000rpm。，弃上清，加入5ml预冷的含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液，用涡旋仪振荡使菌株悬浮，冰上静置20分钟。按100μl菌液每份将新鲜感受态细胞分装1.5mlEP管中，并贮存于-80℃备用。