HDAC1表达载体的构建及其鉴定

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摘要目的：克隆HDAC1基因，构建HDAC1-GFP载体并进行DNA测序和过表达鉴定。方法：从蝌蚪视顶盖提取总RNA后经逆转录得到cDNA文库。PCR 扩增后连接到PTA2克隆载体上，经酶切鉴定和DNA测序验证准确性。将克隆载体与表达载体BICS2-GFP用Xba I和Hind III双酶切后，连接成真核表达质粒HDAC1-GFP，酶切测序鉴定后转染到293T细胞中进行表达，Western Blot检测HDAC1蛋白过表达的情况。43938

结果：重组质粒在经过扩增、纯化后，用Hind III、Xba I 酶切及DNA测序鉴定证明HDAC1基因已完整、正确的插入到BICS2-GFP表达载体中，并在转染了HDAC1-GFP的293T细胞内检测到了HDAC1蛋白的过表达。

结论：实验成功构建了HDAC1-GFP表达载体，并能在真核细胞中正常过表达。

Abstract

Objective: To clone the HDAC1 gene from the optic tectum of Xenopus laevis and construct the expression vector of HDAC1-GFP.

Methods: Total RNA was extracted from the optic tectum and the cDNA library was obtained by RT-PCR. The full length of HDAC1 gene was cloned by PCR, and was ligated to PTA2 clone vector with T4 DNA ligase. The HDAC1 full sequence was confirmed by enzyme digestion and DNA sequencing. The HDAC1 gene was digested by Xba I and Hind III and ligated to expression vector of BICS2-GFP. The recombinant vector of HDAC1-GFP was transfected into human adrenal cells-293T cells and over-expression of HDAC1 protein was detected by Western blotting.

Results: The construct of HDAC1-GFP was confirmed by enzyme digest with Xba I and Hind III and DNA sequencing. The over-expression of HDAC1 was detected in 293T cell by Western blot using an anti-HDAC1 antibody.

Conclusion: We successfully cloned and constructed the expression vector of HDAC1-GFP and identified its expression in 293T cells.

毕业论文关键词：HDAC1；表达载体；构建；表达

Keyword: HDAC1； expression vector； construction；expression.

第一章引言 5

第二章前期准备 5

2.1材料 5

2.2动物饲养 6

2.3新鲜感受态制备 6

第三章克隆载体的构建 6

3．1材料 6

3．2 方法 6

3．3 结果 7

3．4 讨论 8

第四章 HDAC1-GFP表达载体的构建 9

4.1 材料 9

4.2 方法... 9

4.3 结果.....................8

4.4 讨论 10

第五章 HDAC1-GFP表达载体的鉴定 9

5.1 材料 10

5.2 方法 11

5.2.1 293T细胞的传代培养及转染 11

5.2.2 蛋白质印迹（western blotting） 11

5.3 结果 12

5.4 讨论 12

第六章总结 13

参考文献 13

致谢 14

附录.............15

第一章引言

在哺乳动物中枢神经系统中，学习记忆的形成机制与突触的结构和功能的经验依赖性变化密切相关[1]。突触可塑性是学习记忆的神经学基础，而表观遗传调控在突触可塑性过程中起着重要作用。表观遗传学研究主要涉及DNA甲基化、染色质重塑等内容，组蛋白乙酰化，是染色质修饰中一个最普遍的修饰方式，参与记忆形成[2]，主要通过影响氨基酸残基在组蛋白尾巴的状态来调节染色质结构，作为可逆的翻译后修饰调节核小体结构和基因转录[3]。因此，组蛋白乙酰化修饰作为染色质的结构和基因转录的关键调制器，还通过调节乙酰化和去乙酰化作用提供了一种使基因组耦合细胞外的信号机制[4]。组蛋白乙酰化与去乙酰化过程在细胞核内是处于动态平衡的状态，由组蛋白乙酰化转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）共同调节控制。在组蛋白修饰过程中去乙酰化有利于DNA与组蛋白八聚体的解离，核小体结构松弛，从而抑制转录因子和协同转录因子的活性。组蛋白修饰作为表观遗传调控的一种重要机制，具有多种功能信号连接方式，不仅参与调控了基因的转录和沉默、染色质凝聚，还与发育，衰老等生理、以及DNA复制等细胞生命过程密切相关[5]。大量研究发现[6]，HATs 和HDACs 的量及酶活性的变化能调节神经元的易损性，而调节组蛋白乙酰化动态平衡的酶位于细胞核内，因此组蛋白乙酰化状态的平衡在神经元存活中的重要性得到大量关注，同时也有越来越多的证据表明HAT/ HDAC 平衡的紊乱会使基因表达失控，从而导致神经发育失调性疾病和神经退行性疾病的发生。