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表2.2 果胶酶单因素实验水平表
温度
/℃ pH值 料液比
/(g: mL) 加酶量/% 酶解时间
/h
30 2 1:5 0.004 0.5
40 3 1:10 0.008 1.0
50 4 1:15 0.012 1.5
60 5 1:20 0.016 2.0
70 6 1:25 0.020 2.5
7 1:30 0.024 3.0
2.3.2.4. 纤文素酶果胶酶复配实验
（1） 纤文素酶果胶酶配比确定
根据表2.3所列的纤文素酶果胶酶复配因素水平，在温度为55℃、pH值3.5、料液比1:10、酶解时间1.5h的条件下进行复配实验。精确称量样品1.000g，加入pH值3.5缓冲液5.0mL，并用缓冲液分别配制对应配比的纤文素果胶复合酶，复合酶的浓度为0.01%，酶液和样品置于55℃恒温水浴锅预热30min后，取复合酶液5mL加入样品后，置于55℃恒温震荡水浴锅，计时酶解1.5h，每个因素水平3组平行。水解液根据2.4.1所述的DNS法测定还原糖含量。
（2） 纤文素酶果胶酶复合加酶量
根据表2.3所列的纤文素果胶复合酶加酶量单因素水平，在温度55℃、pH值3.5、料液比1:10、酶解时间1.5h、纤文素酶：果胶酶为2:1的条件下进行复合酶加酶量单因素实验。精确称量样品1.000g、分别加入pH值3.5缓冲液9mL、8mL、7mL、6mL、5mL、4mL，并用缓冲液配制纤文素酶：果胶酶为1:2的复合酶液，复合酶浓度为0.01%，酶液和样品置于55℃恒温水浴锅预热30min后，分别取复合酶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL加入样品，置于55℃恒温震荡水浴锅，计时酶解1.5h，每个因素水平3组平行。水解液根据2.4.1所述DNS法测定还原糖含量。
表2.3纤文素酶果胶酶复配因素水平表
果胶酶:纤文素酶 纤文素酶果胶酶复合加酶量/%
1:1 （0.025%:0.025%） 0.01
2:3 (0.020%:0.030%) 0.02
1:2 (0.017%:0.033%) 0.03
1:3 (0.013%:0.037%) 0.04
1:4 (0.010%:0.040%) 0.05
1:5 (0.008%:0.042%) 0.06
2.3.2.5. 纤文素果胶复合酶正交实验
综合以上复合酶配比和加酶量的实验结果以及两个酶单因素实验结果，设计四因素三水平正交试验，表2.4列明了各因素水平表。
表2.4 纤文素酶果胶酶复合酶处理对烟草酶解度影响的正交试验设计
水平因素 温度A/℃ pH B 酶解时间C/h 料液比D/g: mL
1 50 3 1.0 1:10.0
2 55 3.5 1.5 1:12.5
3 60 4 2.0 1:15.0
2.3.2.6. 微生物发酵水解液
（1） 乳酸菌
将乳酸菌菌种充分活化后接入至MRS培养基中，30℃恒温生化培养箱中培养12h，制得种子液；取10g烟粉加入pH值3.5缓冲液100mL，加入纤文素果胶复合酶0.03%（果胶酶：纤文素酶=1:2），在55℃条件下酶解1.5h后高压灭菌处理，冷却后接种乳酸菌种子液，在30℃，120r/min恒温生化培养箱中培养36h，既得发酵产物。
（2） 生香酵母菌