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(8) 按照建立的方法，重复进样；
(9) 通过积分图，处理数据，通过光盘导出数据。
色谱仪2：开机；自检；方法建立；参数设定；检测；数据处理导出。
色谱仪3：同色谱仪2。
4结果与讨论
4.1 用HPLC，C18，手性柱分析751椒碱
4.1.1 用C18柱分析751椒碱
使用Dikma Technologies C18 5u 1524.6柱，流动相甲-醇水6:4每升+25mmol硝酸银和2.5ml冰醋酸，流速1ml/min，检测波长280nm ，常温下检测。测定合成751椒碱、751椒样品、合成751椒碱标样和751椒样品混合谱图见图1.-图3。
图1 合成751椒碱色谱图
(色谱仪2，Dikma Technologies C18 5u 1524.6柱，甲醇水6:4每升+25mmol硝酸银和2.5ml冰醋酸，流速1ml/min，检测波长280nm ，常温)
图2 751椒样品色谱图，色谱条件同图1
图3 合成751椒碱标样和751椒样品混合进样色谱图，色谱条件同图1
通过对合成751椒碱标样和751椒样品的检测，得到了与文献[25]中相似的结果，但这种方法使用添加硝酸银流动相会破坏柱子结构，降低了方法的灵敏度，柱子使用一段时间后出峰重复性变差，而且此方法的检测时间过长，尝试使用其它方法分离751椒碱。
4.4.2751椒样品不同提取液的分析结果
使用C18柱分析751椒碱，尝试了甲醇水的多种比例混合检测751椒碱标样，并检测了甲醇、乙醇和甲醇四氢呋喃超声浸取的751椒样品，在谱图前前部出现响应值较大的重现性很好的峰，与标准品保留时间不一致，怀疑为751椒红素，后又尝试使用氢氧化钠溶液浸洗再用有机相萃取的方法脱去751椒样品中的油脂，但经进一步检测并未得到重复性结果。
4.4.3 用手性柱分析751椒碱
使用CHIRALCEL OD柱，尝试了甲醇-水(9：1,含0.2%三氟乙酸)，甲醇-水（9：1，含0.2%三乙胺），甲醇-水（83：17，正己烷，含0.1%乙腈），正己烷-异丙醇（7：3），正己烷-异丙醇（8：2，含少量三乙胺），正己烷-异丙醇（7：3，含0.1%三乙胺），正己烷-异丙醇（8：2，含0.2%三乙胺），正己烷-异丙醇（9：1，含0.2%三乙胺），正己烷-异丙醇（9：1，含0.4%三乙胺）流动相体系，但并未分离合成751椒碱和天然751椒碱。
使用CHIRALPAK AD-H 0.4625柱，尝试了正己烷-异丙醇（7：3），正己烷-异丙醇（9：1，含0.2%三氟乙酸），正己烷-异丙醇（9：1，含0.5%三乙胺）流动相体系，无法分离合成751椒碱和天然751椒碱。
使用两种手性柱的多种流动相体系分析751椒碱，难以分离751椒碱，谱图重复性差，无法作为分离依据。
4.2 HPLC银离子柱的制备
根据文献查到银离子色谱柱可以分离含有烯键的物质，合成751椒碱和天然751椒碱的主要区别是相差一个烯键，按照文献[36]的方法自制银离子色谱柱。
对文献方法适当改动,本实验的制备方法为：用1%乙酸铵水溶液以0.5ml/min冲洗柱子一小时，再使用蒸馏水以1ml/min冲洗柱子1小时，在这1小时中将1ml 0.2g/ml现配硝酸银溶液以50ul每分钟的方式完成进样，在最后一针进样结束后20min，改用甲醇以1ml/min冲洗1小时，再用正己烷-乙醇7:3以1ml/min冲洗25min，最后用正己烷以1ml/min冲洗1小时，待用。
4.3 HPLC银离子柱用于751椒碱分析
本次试验使用了正己烷-乙腈和正己烷-乙醇两种流动相体系分析751椒碱。
4.3.1 正己烷乙腈体系
使用了三种色谱条件分析751椒碱：
(1)Waters510，银离子柱2，流动相正己烷（含0.6%乙腈），流速1ml/min，检测波长280nm，柱温室温（15.9℃）；
(2) U3000，银离子柱2，流动相正己烷（含0.2%乙腈），柱温35℃，流速1ml/min，进样量3ul；
(3) U3000，银离子柱2，流动相正己烷（含0.2%乙腈和0.1%1mol/l硝酸），柱温35℃，流速1ml/min，进样量3ul。