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    近二十年,一些低毒或无毒的新型抗真菌剂(如碳酸氢钠、亚磷酸盐、精油、硼酸等)用于采后病害防治方面的研究取得了较大进展(Qin等,2007;Xing等,2010;Amiri & Bompeix,2011;De Costa & Gunawardhana,2012)。有研究报道显示,碳酸氢钠(NaHCO3)在多种水果的不同种采后病害防制中起到重要作用(Dore等,2010;De Costa等,2012;Letscher-Bru等,2013;Youssef等,2014)。作为一种广泛用于发酵,pH调节,调节口感和质构的食品添加剂,它被美国食品和药物管理局列为公认安全(GRAS)的化合物,同时由美国环境保护署免除其对所有农产品的残留限量[2]。NaHCO3是一种非常有潜力的杀菌剂替代品,因为它容易获得,便宜而且可以易于控制操作[3]。

    单独使用或结合其他方法(如微生物生物防治剂)使用时,NaHCO3均能减少采后病害的发生率。有研究表明,3%(w/v)NaHCO3能有效降低柑橘上P. expansum导致的绿霉病的发病率,其降低率能达到100%(Youssef等,2014)[4]。采后果实经过300mM NaHCO3溶液浸泡10分钟后,香蕉炭疽病的病斑直径显著减小,香蕉冠腐病,花败腐烂病的发病率也显著降低(De Costa等,2012)。此外,NaHCO3与Rhodosporidium paludigenum(Zhu等,2013),Bacillus amyloliquefaciens HF-01(Hong等,2014),Metschnikowia pulcherrima, Cryptococcus laurentii(Janisiewic等,2008)或Trichoderma harzianum DGA01(Alvindia,2013)结合使用时,其抑制采后病害的效果也很好[5]。NaHCO3还可以增强咯菌腈和噻苯咪唑对采后柑橘类水果绿霉病的防治功效(D. Aquino等,2013)。此外,Dore等人(2010)和Youssef等人(2014)发现NaHCO3可以诱导橘子伤口处结晶蜡形成,激活果实抵抗力以及增加抑霉唑的水平[6]。

    近年来,NaHCO3直接的抗真菌作用也有报道。Letscher-Bru等人(2013)研究了NaHCO3对三大类真菌(酵母菌,皮肤癣菌和霉菌)中的70种真菌菌株的抗真菌活性[7]。De Costa等人(2012)则在体外实验中发现,NaHCO3可以抑制Colletorichum musae真菌的孢子产生、萌发,菌丝生长及附着胞的生产[8]。但是, NaHCO3单独用于抑制水果采后青霉病的研究目前未见报道。

    本研究分离自然发病的梨青霉菌,并通过超微结构分析、生理、生化指标(孢子萌发率、芽管伸长速度、生物量、菌落扩展速度、活体接种发病率及病斑直径)测定,确定碳酸氢钠处理对P. expansum生长发育的影响。本研究为采后病原菌的防治提供了新的思路。

    2  材料与方法

    2.1 菌种及试剂

    实验所用病原菌Penicillium expansum分离自自然发病的梨[9]。碳酸氢钠,碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)购自美国Sigma公司,PCR所需试剂购自日本TAKARA公司,其他主要试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司,DNeasy Plant Mini Kit(Cat. No. 69106)及Gel Extraction Kit(Cat. No. 28706)购自德国Qiagen公司。梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)果实购自当地市场。

    2.2碳酸氢钠最低抑菌浓度的确定及对P. expansum芽管伸长的影响

    利用75%的无水乙醇对发病梨果实进行消毒,风干后在病斑边缘去除果皮,切取面积为0.1 cm2左右的果肉置于PDA(potato dextrose agar)培养基上,25 ℃培养24 h后,在菌落边缘分离菌种,转移至新的PDA培养基上,25 ℃培养4天,观察、拍照后,用含有0.05%(v/v)Tween-20的无菌水收集孢子,经4层无菌纱布过滤后使用。将孢子悬浮液加入PDB(Potato dextrose broth)培养基中,调节终浓度为1.0×106 spores·mL-1,摇床振荡(25℃,200 rpm)培养12 h后收集菌丝。

    将分离的病原菌P. expansum接种在PDA培养基上,25 ℃培养箱中培养1周,按以上中所述方法收集孢子。将P. expansum孢子悬浮液等量加入到含有100 ml PDB培养基的250 ml三角瓶中,调节孢子终浓度为1.0×106 spores·mL-1,分别加入不同浓度的碳酸氢钠(0、0.15%、0.3%、0.45%,0.6 %( m/v))。25 ℃、200 rpm振荡培养,分别在6-10h后用光学显微镜统计孢子萌发率(当芽管长度大于等于孢子直径的1/2时视为孢子萌发),确定碳酸氢钠的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC,本文指相同培养时间空白组孢子萌发率≥85%时,处理组孢子萌发率≤10%时的浓度),并分别在11-14h后利用显微镜镜头标尺测量最低抑菌浓度处理组芽管的长度[10]。每种处理随机统计100个孢子的萌发率及芽管长度,三次重复,整个实验重复两次(Thao et al.,2008)。

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