利用GENBANK数据库开发黄鳝SSR标记(2)

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当前，虽然对黄鳝的微卫星筛选工作已有报道，但取得的微卫星数量有限，黄鳝分子标记仍然十分匮乏，随着科学的进步SSR标记技术会广泛的运用到黄鳝中，目前中国黄鳝种质资源日趋贫乏，准确的遗传鉴测对黄鳝品种改良、遗传研究、优良性状基因的利用具有重大意义[6]。

表 1 已开发出微卫星标记的鱼种节选

鱼种名称参考文献

褐牙鲆 (Paralichthys olivaceus)

大菱鲆 (Scophthalm us maximus)

红点鲑 (Salvelinusalpinus)

虹鳟 (Oncorhynchus mykiss)

臼齿海鲽 (Pleuronectes platessa)

三线矶鲈 (Parapristipoma trilineatum)

金头鲷 (Sparusaurata)

虹鳉 (Poecilia reticulata)

夏威夷石斑鱼 (Epinephelusquernus)

牙鳕 (Merlangius merlangus) [7]

2.材料和方法

2.1从GENBANK数据库下载黄鳝核苷酸序列

首先，在百度中输“http://www.ncbi.nlm.nih.gov”网址，在搜寻的数据库选择nucleotide，在NCBI中输入黄鳝的拉丁文“Monopterus albus”，然后，点击“Search”将出现大量搜寻到的黄鳝序列，点击搜寻结果中“Send to”后的下拉箭头，打开保存对话框，保存类型选择“File”，保存格式选择“FASTA”，分类按照“Data Modified”，选择好各选项后，点击“Create File”，将生成的文件自己命名放入word文件中，并保存在适当位置。在生成的word文件中，分别将每一条序列开头部分复制到“Excle 1”工作表中，并且，将每条序列开头的部分替换成“>”开头，这样方便在软件中查找SSR序列。

2.2黄鳝微卫星核苷酸序列的查找

打开“SSRHunter 1.3”软件，打开含有序列的word文件，依次将每一百条序列，1-100，01-200，201-300，301-400，401-500，501-600，601-700，701-800。依次复制粘贴到“SSRHunter 1.3”软件中，点击在构成重复元件的核苷酸数最多为4个（tetramer）上，确保查找的碱基数量标准。点击“SSR位点搜索”，搜索结果将以弹窗的形式出现。将搜索的结果依次保存，即1-100的编号序列搜索结果保存到word 1中，101-200的编号序列搜索结果保存到word 2中，201-300的编号序列搜索结果保存到word 3中，301-400的编号序列搜索结果保存到word 4中，401-500的编号序列搜索结果保存到word 5中，501-600的编号序列搜索结果保存到word 6中，601-700的编号序列搜索结果保存到word 7中，701-740的编号序列搜索结果保存到word 8中。筛选黄鳝SSR的标准，三核苷酸重复次数大于4，四核苷酸重复次数大于3，五核苷酸次数大于2。文献综述

2.3黄鳝微卫星引物的设计

首先，打开Priemer Primier 5软件，点击“File”在点击“New”接着点击DNA Sequence，将word 1、word 2、word 3、word 4、word 5、word 6、word 7、word 8中的序列依次复制粘贴到Primer软件空白区域，直接点“OK”即可。点击“Primer”，会出现一个对话框，然后点击“Search”，又会弹出一个对话框，在对话框中设置“Sense Primer”介于“1 to 150”，“Anti-sense Primer”介于“200 to 310”，设置完成后，点击“OK”，会弹出另外一个对话框，再点“OK”。之后会弹出“Search Results”的对话框，选择“Sense”则下面列表中均为软件设计好的正向引物（蓝色字体）；选择“Anti-sense”时，表中显示的均为反向引物（红色字体）。选中任意一个正向或反向引物，左侧“Primer Premier”窗口中就会显示相应引物的位置和信息。按照引物设计原则，挑选得分最高的上下游引物组合作为最终设计的引物。并且有截图方法将引物设计的结果截图，与相应DNA序列对应保存，以便后续验证和修改。