利用GenBank数据库开发泥鳅EST-SSR标记

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摘要：从 GenBank公共数据库中下载泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)表达序列标签（Expressed Sequence Tag, EST）22174条，选取前1000条序列利用“SSRHunter 1.3”软件进行SSR位点查找，获得67 条含微卫星重复单元的序列，占所选EST序列总数的6.7%。利用Primer Premier 5.0软件设计了73对SSR 引物，其中54对引物来源于双碱基重复序列，18对来源于三碱基重复序列，1 对来源于四碱基重复序列。本研究所用的微卫星开发方法比传统方法经济、高效，所开发的EST-SSR标记在今后泥鳅遗传多样性分析、关联分析、功能基因定位、遗传图谱构建、比较基因组作图及分子标记辅助育种等研究中具有重要理论和实际意义。60160

毕业论文关键词：泥鳅，GenBank数据库，EST-SSR标记

Abstract：In this present study, 22174 expressed sequence tags (ESTs) of loach (Misgurnus anguillicaudatus) were download from the GenBank public database, and 1,000 ESTs were randomly selected to search simple sequence repeats (SSRs) using the SSRHunter 1.3 software. Finally, a total of 67sequences (6.7% of the 1,000 selected ESTs) containing SSRs were found out and 73 pairs of SSR primers, including 54 di-nucleotide repeat, 18 tri-nucleotide and 1 tetra- nucleotide SSR primer pairs, were designed applying the Primer Premier 5.0 software. The approach of mining SSRs markers used in this study is benefit and efficient compared with normal methods, and EST-SSRs developed in this study will be useful in researches of Loach on genetic persity analysis, correlation analysis, functional gene location, genetic map construction, comparative genomics and marker-assisted selection breeding.

Keywords：Misgurnus anguillicaudatus, GenBank database, EST-SSR marks

1 前言 4

2 材料和方法 5

2.1 从GENBANK数据库下载泥鳅核苷酸序列 5

2.2 泥鳅微卫星的查找 5

2.3 泥鳅引物的设计和整理 5

3 结果 6

3.1 　微卫星序列搜索结果 6

3.2 　微卫星引物设计及可用引物筛选 7

4 讨论 14

参考文献 15

致谢 16

1 前言

泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus），属鳅科，杂食性小型淡水鱼，广泛分布于中国、日本、朝鲜、俄罗斯及印度等地，在我国除青藏高原外，全国各地河川、沟渠、水田、池塘、湖泊及水库等天然淡水水域中均有分布，尤其在长江和珠江流域中下游分布极广，群体数量大。泥鳅被称为“水中之参”，有很高的营养价值和经济价值。国内外市场广阔，是我国重要的小型淡水经济鱼类[1]。

SSR(simple sequence repeat 简单重复序列)，又称微卫星(microsatellite)STR(short tandem repeat 短串联重复)，在人类和其他动植物基因组中分布广泛，SSR分子标记特点如下:(1)在基因组中分布广泛、随机、均匀；(2)SSR标记两侧的序列顺序比较保守；(3)很多SSR标记无具体的功能作用，重复序列增加或减少的频率较高，位点变异在品种间发生广泛；(4)SSR标记表现出共显性的孟德尔式遗传方式；(5)扩增时模板DNA需要量少，即使DNA降解，也能有效地分析鉴定。基于这些特点，SSR标记已成为最为重要、应用最广的分子标记。SSR标记已经在动植物遗传连锁图谱的构建、遗传多样性研究、品种鉴定、外源染色体片段或目的基因鉴定和定位、分子标记辅助选择育种等方面得到应用。传统的SSR标记引物设计过程较慢，需要进行基因组文库的构建、重复序列克隆的识别和筛选、测序、引物设计等繁多环节。获得SSR引物花费的时间长、费用大且效率低。但是ESTs(expressed sequencetags, ESTs, 中文直译为表达序列标签)的出现为SSR的发展提供了新的来源。ESTs是一段短的cDNA序列，大约200～700bp，伴随着大规模植物基因的测序工作而产生，作为某一基因的特有序列，早期用来在DNA和蛋白质数据库中搜索查询相似的基因。ESTs近年来发展十分迅速，在GenBank上能够检索的泥鳅序列就有数万条之多，并且数目正不断增加。ESTs为SSR标记的创制提供一个巨大的、有价值的来源，能够克服SSR引物在创造时费用高的问题。这种标记为了与传统的SSR标记相区别，一般称之为EST-SSR标记(EST Microsatellite Marker)[2]。作为一种新的SSR标记的来源，EST-SSR标记已经在众多动植物种类中得到证实和应用，利用GenBank数据库开发泥鳅EST-SSR标记对于泥鳅的遗传学研究有重要意义。