反刍动物的肉、奶及其制品是CLA的天然食物来源,但含量普遍较低,如牛肉脂肪中CLA平均含量为3- 4 mg/g ,乳脂中CLA的为2-25 mg/g不等[5];一般植物油的CLA含量只有0.1- 0.7 mg/g,而FDA推荐成人的摄入量为3-4g/d,所以日常的CLA的摄入远远不够,这就说明工业化生产安全的共轭亚油酸将很有竞争力和市场。
不同构型的CLA单体在生理功能上存在一定差异,且对制备CLA 异构体单体的技术要求很高,目前出售cis-9,trans-11-CLA 单体只有瑞典的Larodan 公司和美国的 Matreya 公司,售价高达 120美元/克。只有 Matreya 公司有少量标品 trans-10,cis-12-CLA 出售,最大包装售价3000美元/克。因为化学合成法合成的CLA由于安全性问题难以应用到保健和食品行业,所以迫切需要生物合成安全且功能明确的CLA。当生物催化合成的粗提物中cis-9,trans11-CLA 和 trans-10,cis-12-CLA 的纯度达 75%时,就能基本满足保健品及食品生产原料的要求,且价格要便宜很多。据估计,目前仅在国内,市场对cis-9, trans-11-CLA 和 trans-10, cis-12-CLA粗品的需求量高达5吨/年[6]。
随着科技的发展和技术的进步,人们对于共轭亚油酸的作用机理将会越来越清楚明晰,对于生产单一、安全的共轭亚油酸的技术也会越来越成熟。同时人们对CLA 异构体功能的逐步了解,及对健康水平要求的日益提高, CLA应用于在化妆品、功能性食品、饲料等领域的应用也会越来越广,它的市场潜力也会越来越诱人,若应用范围进一步拓展到医药领域,其市场需求还会大大增加。
CLA的合成方法包括化学合成法和生物合成法,化学合成法一般采用碱法异构化,以亚油酸和富含亚油酸的植物油为底物使用碱催化剂催化异构化反应生成CLA,转化率高,产量高,但是产物是多种异构体的混合物,成分复杂,包含了多种CLA的异构体及环化副产物,其中环化副产物对人体的安全性未知,此外化学合成法多用酸碱作为催化剂,污染环境,也可能有溶剂残留,不利于健康,为CLA应用于医药和功能性食品行业带来了很多安全性隐患。而且化学合成共轭亚油酸的中的cis-9,trans-11-CLA 和trans-10,cis-12-CLA两种异构体的含量比约为1:1,难以分离[7,8]。即使后期采用多用纯化技术获得单一产品,成本高昂,不利于产品的开发。作为一种潜在的功能性食品,这种方法并不适合生产共轭亚油酸,无法使共轭亚油酸的功能发挥到最大。
共轭亚油酸的生物合成法是亚油酸经亚油酸异构酶直接合成共轭亚油酸的生物转化过程。生物法合成共轭亚油酸的反应条件温和,产物异构体单一,易于操作和控制,主要异构体是c9,t11-CLA和t10,c12-CLA且安全性高[9]。所以通过生物技术生产单一,安全的CLA活性异构体成为CLA合成技术的发展趋势。文献综述
合成共轭亚油酸的底物是亚油酸,传统上,工业生产脂肪酸通过Colgate Emery连续分解装置,在250℃高温,5000KPa的条件下将甘油三酯水解成脂肪酸。然后,把需要的脂肪酸分离并纯化。但是,此过程副反多应且产物纯度较低,而且能耗高。而酶法生产脂肪酸因为反应条件温和而备受关注,而且酶法生产脂肪酸的能耗低且产品纯度高[10]。所以我们希望以低价的富含亚油酸的红花籽油为原料通过酶法生产亚油酸,在把亚油酸作为生物合成共轭亚油酸的底物,加入亚油酸异构酶,生物合成安全单一的共轭亚油酸。而酶法生产亚油酸的关键是脂肪酶,由于食用型脂肪酶的来源比较简单,价格比较低廉,因此我们希望能从食用型脂肪酶中筛选出一个合适的脂肪酶。
本实验以实验室已经构建的来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶(PAI)大肠杆菌表达系统为起点,探索出了最佳发酵条件,并在最佳反应条件与脂肪酶共发酵,以红花籽油为底物,以LA转化率和CLA的产率为筛选条件,从8种脂肪酶中筛选出最佳的脂肪酶,创建双酶联用体系,生物合成共轭亚油酸。