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摘要：本实验主要通过七叶苷显色法从已构建的云南土壤微生物宏基因组文库中筛选出纤文素酶阳性克隆体，并对其进行体外异源表达。从云南土壤微生物库中筛选出编号为963的阳性克隆体，通过序列分析获得产纤文素酶基因YNBG3，将其成功进行体外异源表达。利用宏基因组技术可以发掘非培养微生物中的纤文素酶基因。29829
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毕业论文关键词：纤文素酶；土壤宏基因组；表型筛选；异源表达
Screening and Expression of a Novel Cellulase
Abstract: In this study， the cellulase-positive clones were screened out from the constructed microbial genome of soil microbes in Yunnan， and the heterologous expression was carried out in vitro. A positive clone of 963 was screened from the soil microbial library of Yunnan. The cellulase gene YNBG3 was obtained by sequence analysis， and its expression was in vitro. The use of macro genome technology can be found in non-cultured microbial cellulase gene.
Key words: Cellulase; Soil macro genome; Phenotypic screening; Heterologous expression
目 录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料2
1.1.1 实验样品2
1.1.2 培养基2
1.1.3 酶及生化试剂2
1.1.4菌株和载体3
1.1.5 实验仪器3
1.2 实验方法3
1.2.1 云南土壤宏基因组文库纤文素酶活性筛选3
1.2.2 质粒的提取3
1.2.3亚克隆的制备4
1.2.4 目的基因的获取和测序4
1.2.5 目的基因的引物设计与合成5
1.2.6 目的基因的PCR合成 5
1.2.7 克隆载体和载体的酶切和回收5
1.2.8 连接6
1.2.9 感受态的制备6
1.2.10 纤文素酶重组子的筛选及鉴定6
1.2.11 重组子的验证6
1.2.12 菌种的保存 6
1.2.13 重组子的诱导表达6
1.2.14 粗酶液的收集7
1.2.15 纤文素酶的亲和层析7
1.2.16 纯化蛋白的SDS-PAGE凝胶检测7
2 结果与分析7
2.1 纤文素酶活性克隆菌株的筛选8
2.2 纤文素酶基因的PCR扩增8
2.3 克隆产物和表达載体的双酶切9
2.4 纤文素酶重组子的鉴定10
2.5 纯化蛋白的SDS-PAGE凝胶检测10
2.6 纤文素酶蛋白浓度的确定11
3 结果与展望11
致谢12
参考文献13
一种新型纤文素酶的筛选和表达
随着经济的发展和生产、生活水平的进步，社会面临能源短缺和环境污染等问题也越发加剧，传统资源如煤炭、石油等不可再生资源对环境破坏严重，而且随着时间的推移，数量也越来越少，开发一种新型环保的资源显得格外重要，纤文素作为宝贵的自然资源之一，清洁环保，在能源利用方面起着重要的作用，同时纤文素在食品、药学等领域也发挥着重要作用[1-6]。纤文素主要由植物的光合作用产生，同时人们生产生活也会产生大量的纤文素，如稻草、秸秆、果壳等，因为目前生产和利用纤文素的技术存在一定局限，绝大部分的纤文素往往作为废弃物被抛弃而不能被充分利用。其中的主要原因是纤文素是高分子物质，需要被分解为单糖后才能充分应用于生产生活。因此研究者越来越多得将研究重点放在纤文素酶上。
纤文素酶能将高分子的纤文素水解成单糖，进而发酵成为乙醇，并且纤文素酶反应条件温和，特异性高，如果能够充分利用，会在环境保护，资源利用等方面将起着重要作用。研究表明，纤文素酶主要是由微生物代谢产生的，因此分离纯化产纤文素酶的微生物成为众多研究者研究纤文素的重要步骤。一直以来研究者会选择从样品中分离出能够利用纤文素的微生物，将这些微生物进行纯培养，再从其体内提取纤文素酶的方式发现新的纤文素酶。但是目前自然界中大部分微生物不能通过纯培养的方式分离获得，因此利用纯培养方法筛选出的产纤文素酶的微生物种类比较单一，重复率也相当高，不利于人们对纤文素酶的发现及利用。