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1.2.4 低温胁迫的研究情况
温度胁迫是影响作物产量和地理分布的重要环境因子之一，因此认识植物生长过程中如何适应温度胁迫的机理，对于应对环境变化对农业生产、园林应用有至关重要的影响。目前，关于低温的研究范围很广泛，包括植物的生理、生化，植物的组成等各个方面。如有文献报道指出细胞膜中不饱和脂肪酸和磷脂含量与植物抗寒性有密切的关系[16，17]，实验证明，抗寒性较强的植物中膜脂不饱和度较高，高不饱和度能够使植物在较低的温度下保持膜脂的流动性，文持正常的生物功能。低温胁迫关于各种种类的植物，例如玉米[18]、苜蓿[19]、白菜[20]等，有关一些苦苣苔科植物的研究也已发表，葛亚英、田丹青等人研究表明昼/夜温度在12ºC/8ºC以上对口红花叶片影响不大,4ºC/0ºC以下低温会造成口红花叶片死亡,其耐寒性鉴定可选在昼/夜低温8ºC/4ºC下进行[21]。但是，国内现在尚无与牛耳朵这一苦苣苔科植物抗寒性相关的文献。
1.3 牛耳朵的研究意义
本研究旨在为今后苦苣苔牛耳朵的研究提供理论基础，并且扩大牛耳朵的种植以及利用区域，使牛耳朵的园林作用与药用价值为人们更广泛的应用并向北方地区发展，真正在国内流行起来。
基于以上对牛耳朵生理研究的未深入性，本文以牛耳朵组培苗为材料，对牛耳朵幼苗至于5℃低温下进行不同时间低温胁迫处理，然后进行不同时长的恢复处理，对处于低温胁迫下和恢复正常环境之后的各项生理生化指标进行，叶绿素荧光参数Fv/Fm、叶片相对含水量、细胞液渗漏、SOD活性、MDA含量等进行测定和分析，以探明牛耳朵对低温胁迫的生理响应，为牛耳朵的人工栽培提供基础理论依据。
2 材料与方法
2.1 实验材料
以野外采集的牛耳朵为母本，进行植物组织培养，获得的组培苗作为研究的材料。组培苗移栽至72孔穴盘进行驯化栽培60天，然后在其中挑选长势、大小基本一致的幼苗移栽到上口径为70mm，高为80mm的的方形塑料培养穴盘。基质配比为草炭60%，珍珠岩20%，蛭石20%，放置于温室栽培，隔天浇水一次，栽培4个月后用于试验。
2.2 实验试剂：
蒸馏水、0.05mol/L 磷酸缓冲液、130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液、750μmol/L 氮蓝四唑溶液、20μmol/L核黄素溶液、0.5%硫代巴比妥酸、5%三氯醋酸、石英砂。
2.3 实验器具和仪器设备
⑴ 器具：培养皿、培养穴盘、剪刀、烧杯、托盘、培养瓶、标签纸、研钵、培养瓶、打孔器、玻璃棒、试管
⑵ 设备：电导率仪、PAM2500型便携式叶绿素荧光仪、天平、恒温水浴、烘箱、离心机、
分光光度计、制冰机
2.4 实验方法
2.4.1 预备实验
先将牛耳朵幼苗在0ºC、5ºC下处理，观察发现0ºC处理6h时，牛耳朵叶片明显萎蔫，即为明显冻伤，再继续低温（0ºC）处理12h时，发现幼苗全部死亡。因此本实验将选取5ºC的低温条件进行牛耳朵幼苗的冷害试验。
2.4.2 牛耳朵处理方法
将需要进行处理的牛耳朵从温室转移到光照培养箱，在25ºC，光照16h黑暗8h进行适应性培养7d。选取长势一致的植株分为4组，每组24盆。1组作为对照，继续置于25ºC光照培养箱内生长。剩下的3组分别置于温度设定为5ºC的光照培养箱中处理，记为A、B、C。
A：在5ºC的光照培养箱中处理12h，其中1/3幼苗（8盆）在12h的低温处理结束后立即用于测定生理指标，还有1/3幼苗（8盆）重新置于25ºC，光照16h黑暗8h下恢复生长24h后测定生理指标，另一部分1/3幼苗（8盆）重新置于25ºC，光照16h黑暗8h下恢复生长48h后进行生理指标测定。