在前导肽引入N-糖基化位点促进弹性蛋白酶在毕赤酵母中的表达(4)

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引入的N-糖基化位点突变：酶蛋白的氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr是潜在的N-糖基化位点，为了在重组弹性蛋白酶前导肽中引入N-糖基化位点，需要选择性突变相应的氨基酸残基，使酶蛋白氨基酸序列中出现新的Asn-Xaa-Ser/Thr。在选择突变位点时，突变氨基酸的位置要避开或是远离弹性蛋白酶中具有一定功能的氨基酸残基，也就是说我们要避开或远离活性部位关键氨基酸残基、参与锌离子和钙离子结合的氨基酸残基以及二硫键形成的氨基酸残基；另外在空间结构上也不能靠近要这些功能部位，以免引入氨基酸残基的突变和N-糖基化修饰干扰其正常的功能[26]。

在实际实验过程中，新引入的蛋白N-糖基化修饰位点（Asn-Xaa-Ser/Thr）的Asn（天冬酰胺）也存在着未被糖基化的可能，因此，也需要考虑新引入的N-糖基化位点会被糖基化的概率或可能性。通过计算比较各个新设计的N-糖基化位点被糖基化的可能性，最终确定了N11、N51、N95和N129四个位点为新引入的N-糖基化位点，相应地将这四个氨酸后两位突变为苏氨酸，即D11N、K53S、A95S和K129S。预计得到相应四个突变体的N-糖基化位点，蛋白突变体的四个N-糖基化位点即D11N、K53S、A95S和K129S。