在前导肽引入N-糖基化位点促进弹性蛋白酶在毕赤酵母中的表达(3)

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前导肽的位置在全蛋白的信号肽和功能区域中间，对大多真核生物和原核生物而言是非常重要的组成部分，常常行使着分子伴侣的作用，即帮助它们相连的蛋白质正确的折叠和表达[15-19]。自然情况下，前导肽会帮助它们相连的蛋白正确的折叠和表达，并进一步展现生物活性，但是如果前导肽编码基因发生了一定的改变，那么会不会影响目标蛋白的生物活性呢？针对这一问题，Inouye 等在1997 年研究发现了位于 subtilisin E 前导肽上的突变点 I48V 可以引起目标蛋白表现出不同的热稳定性和不同底物特异性的现象[20] 。这个研究结果开始引导民众们更加关注前导肽序列的优化和改造，且想要通过这种途径来得到生物性能优化的目标蛋白。文献综述

Raphael 等在2010 年对分子伴侣 Dna K 的定向进化进行研究，这些研究让我们有了新的认识，研究显示这个分子伴侣盖子区域（而非功能区）的一些突变可以改变了分子伴侣活性的现象[21] 。那么，如果前导肽类的突变甚至进化会不会对全蛋白产生重要的效应？这个问题我们能够在 RML 前导肽突变对于全蛋白活性影响的研究中找到答案。实验通过易错 PCR 技术对包含前导肽部分的 RML 全蛋白基因进行了定向进化的研究，结果显示前导肽位点的突变D64 A 及 V67 A 都使得全蛋白的活性得到明显提高[22]。这说明前导肽上发生突变能够影响目的蛋白的活性是存在一定规律的，如果一段结构原来没有催化的功能，那它发生变化也可能会引起目的蛋白最终活性的改变，这个观点促使我们的研究不局限于改造对蛋白功能区，处罚了本文的研究。

通过查阅相关文献我们知道，外源基因能否成功表达的一个关键环节是选择合适的蛋白表达系统，然而毕赤酵母最近几年开始发展，它是相对而言较完善的、广泛应用的一种甲醇营养型酵母表达系统，和其他的表达系统相比，该系统所具有着许多优点与优势使其研究价值和应用价值越来越广泛[23]，通过毕赤酵母已经成功表达了多种蛋白质，因此在本实验中我们选用毕赤酵母作为表达载体。

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统发展于1970年，之后逐渐广泛被接受的一类新型的外源蛋白表达系统，和原核表达系统相比较，毕赤酵母表达系统有着比如可操作性简单、更加容易培养、生长速率高、表达量好、低廉的成本等诸多优势[24]。但也不是尽善尽美的，比如有些蛋白在利用毕赤酵母系统分泌表达时会有糖基化问题的出现，造成最终获得纯化的目的产物时带给我们很多不必要的麻烦，现在我们利用基因工程中点突变的方法在前导肽中引入N-糖基化位点的方法来判断这样是否可以促进弹性蛋白酶在毕赤酵母中的表达。

改造毕赤酵母N-糖基化问题通常有以下几种方法：通过调整培养基成分来达到降低目的产物糖基化的目的；尽量不影响蛋白的活性和功能的前提下，可以利用定点突变的方法来改变蛋白糖基化位点以达到阻止糖基化的目的，如将糖基化位点Asn-Xaa-Ser/Thr结构的Asn定点突变为Ala，可以完全阻止糖基化；通过诱变处理选育目的产物糖基化程度较低的菌株；利用基因工程方法改造N-糖基化可以达到同样的目的[25]。来~自^751论+文.网www.751com.cn/

因为利用定点突变技术在氨基酸序列中引入N-糖基化修饰位点是蛋白引入N-糖基化修饰的一种具有良好可操作性的蛋白改造方式。本实验在前导肽四个不同位点尝试性地引入N-糖基化位点，在N-糖基化修饰的作用下可能会促进弹性蛋白酶在毕赤酵母中的表达。因此本实验研究了在前导肽引入N-糖基化位点促进弹性蛋白酶在毕赤酵母中的表达与否。