1.1.3植物组织培养的主要途径【9】
植物组织培养的主要途径有以下五种:
(1)胚胎培养
是指把胚(包括成熟的或者没有成熟的)从胚珠当中提取出来作为组培的外植体。
(2)器官培养
指的是选取的外植体为根茎等植物器官,例如根尖,茎节和切段植物茎的茎尖、植物的叶原基,以叶柄、叶鞘、子叶和叶片,在无菌条件下,离体培养一些花器列如花瓣、雄蕊花药、果实等。往往在形成小芽的同时或之前也形成少量的愈伤组织【10】。
(3)组织培养
这里主要是指狭义上的组织培养,指的是从完整地植物体中分离出一些例如:分生组织、韧皮部、木质部、皮层、表皮、薄壁组织、胚乳组织等各个部位的组织作为组织培养的外植体,也可以选取已经被诱导形成愈伤组织的组织作为外植体来进行培养。
(4)细胞培养
这种方法是指,从植物的组织或器官中,提取出单个的细胞,例如用特定的方法采集花药、卵细胞等来作为外植体来进行体外的无菌培养。
(5)原生质体培养
此法是指去掉植物细胞的细胞壁留下原生质体,用原生质体作外植体在体外无菌培养。
1.1.4植物组织培养的一般步骤【11】
植物组织培养的步骤简单概括为:选择适当的外植体——剪接植物器官或组织——经过脱分化(也叫去分化)形成愈伤组织——再经过再分化形成组织或器官——经过培养发育成一颗完整的植株。过程大致为:
(1)培养材料的采集
组织培养所用的材料非常广泛,可采取根、茎、叶、花等材料,有时也利用花粉粒和花药,其中根尖不易灭菌,一般很少采用。对于木本花卉来说,可以采集生阔叶树一两年生枝条上的部分。我们一般采集针叶树的种子,提取其内部的胚轴或者是子叶。对于草本植物,茎尖常常是被采集的对象。 在快速繁殖的实验中,我们常常选取茎尖作为植物组织培养的外植体,通常将它们切为0.5厘米左右,如果想要培养并获得无病毒苗,我们常常选取茎尖处的分生组织部分作为培养的材料,长度并且要在0.1毫米以下。
(2)培养材料的消毒
①先用洗衣粉将选取的材料洗得干净一点,然后用自来水洗去表面的洗衣粉残液,再用蒸馏水洗净,必要时可用毛笔轻轻刷外植体的表面。
②在无菌坏境中,把外植体放置在盛有75%的酒精的无菌烧杯中中浸洗,时间切忌不可过长,一般30秒(视情况而定)左右较为适宜,如果时间过短,则不能消毒干净,时间如果过长,则会杀死外植体,具体消毒时间根据选取的外植体不同而不同【12】。
③然后把外植体在无菌环境里转移到盛有0.1%的升汞溶液中浸洗消毒,具体消毒时间根据选取的外植体不同而不同。
④取出后用无菌水冲洗多次,直到冲洗干净。
(3)制备外植体
在超净工作台上(或无菌环境中)用剪刀、镊子等工具剪去前面消毒过的外植体,嫩枝外皮将被剥掉,剪去芽的鳞片以及种皮和胚乳等,但是不需要将叶片的皮剥去。然后再将其切成0.2厘米-0.5厘米厚的小片,这就做好了外植体。在操作中用手触碰实验材料是绝对不可以的,以防污染。
(4)接种和培养
①接种 在超净工作台上,将已经切好的外植体立即接在培养基上,大约每瓶接种4个左右,最好每瓶接一个。