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1.4.3 肽键的形成方法
在正常的条件下，羧基和氨基形成肽键的过程不是自发的，这两个基团中必须有一个转变为更加活泼的形式，通常总是把羧基活化。
（1）羧基活化法 羧基不是一个好的离去基团，因此它本身并不是一个良好的酰化试剂。羧基的活化是将羧基转变成一个活泼的羧酸衍生物，提高其酰基化的能力。常用的活化方法有酰氯法、酸酐法、活化酯法和叠氮法等。
（2）偶联剂缩合法 偶联剂本身是一种脱水剂，它能促使羧基和氨基之间发生缩合反应。缩合剂可以直接与一个羧基被保护的氨基酸和一个氨基被保护的氨基酸一起进行反应。最有效的缩合剂是二己基亚胺（DCC）,它能先与一分子氨基酸的羧基进行反应，生成类似酸酐的中间产物，这个不稳定的中间产物进一步与第二分子氨基酸的氨基作用，最终形成链状的肽键。反应产生的二己基脲不溶于大多数的有机溶剂，一般呈白色的状，很容易通过过滤的方法与产物分离。
1.4.4 环二肽成环反应策略
1）分子内的N1-C2成环，将羧基制成活泼酯后脱去N-端保护基，然后成环，常用的活泼酯有硝基苯酷(ONP)、N一轻基唬拍酞亚胺(OSu)和五氟苯醋(PfP)等。2）分子内的N1-C6成环，通过酞胺的a一卤化物在碱性条件下成环。3）分子间N1-C2/C3-N4成环，一般通过a-氨基酸与二价亲电子试剂反应。4）分子间N1-C2/N4-C5成环，合成产率不高。5）分子间C2-N1-C6成环，一般利用N端取代氨基酸作为反应试剂参与成环反应。
图1.4.4.1 五种成环反应的机理
1.4.5 硅胶柱层析法
硅胶层析法是根据物质在硅胶上的吸附力和在溶剂中的溶解度不同而得到分离。它有正相与反相之分，两者的区别在于固定相与流动相极性的相对大小不同。① 正相层析中固定相的极性大于流动相，固定相为支持剂吸附着的一层不会流动的结合极性物质，流动相是与之不互溶的非极性或极性较小的溶剂。因此，在正相层析中极性小的组份先出峰，极性大的后出峰，适用于分离极性化合物。②反相层析：固定相为非极性基团，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基与苯基等，流动相用强极性溶剂，如水、醇等。最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶剂，水不仅起洗脱作用还可掩盖载体表面的硅羟基，防止因吸附而至的拖尾现象。极性大的组份先出峰，极性小的组份后出峰，恰好与正相层析法相反，故称反相层析。
本次实验，运用的是正相硅胶层析，用梯度洗脱时，极性较大的物质容易被硅胶吸附，所以跑得比较慢，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，跑得比较快，我们采用极性梯度洗涤的方法将物质分开。整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。在此过程中要注意以下两方面。
a)洗脱剂的选择
洗脱剂的极性一般比泡硅胶的溶剂的极性要大，一般采用两种或三种极性不同的溶剂混合使用。如：正己烷和乙酸乙酯混合，二氯甲烷和甲醇混合，石油醚、乙醇和水混合等。洗脱剂的极性选择，要根据所需分离的的目的产物和副反应的的产物等杂质的极性大小。若目的产物与杂质的极性相差很大（TLC检测两者的Rf值相差很大）且杂质单一时，可以直接用极性较大的洗脱剂来洗脱；若目的产物与杂质的极性相似（TLC检测两者的Rf值相近）时，先用极性较小的梯度洗脱，再用较大的极性洗脱。尤为重要的是在洗脱的过程中，要不断地进行TLC检测，并且要与未纯化之前的物质进行对照，直到两者的Rf值相同，方可知道是所需的目的产物。
b)色谱柱层析进样
进样方法有湿法进样和干法进样两种。湿法进样就是直接将样品缓缓滴于色谱柱的硅胶上，再用适当极性的洗脱剂进行洗脱。当样品是油状液体或者溶解性较差时，我们将它加热融化，称取同等质量的硅胶，将液体逐滴加入硅胶上，待干，再加液体，待干，重复操作，碾碎成粉末，再进样，最后用适当极性的洗脱剂洗脱，我们称之为干法进样。