马铃薯支链淀粉的链长分布及其与淀粉理化特性的关系(2)

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2 材料与方法

2.1 实验材料

5个马铃薯转基因株系：glgB-2、glgB-6、glgB-9、glgB-21、glgB-24和马铃薯对照Desiree。

2.2 实验方法

2.2.1马铃薯淀粉的提取

将每个转基因株系5株马铃薯植株的薯块混合后，取0.5kg马铃薯洗净后晾干，用钢丝球将皮搓去，切成2-3 cm小块，用1 L含0.1% Na2SO3的蒸馏水匀浆，4层纱布过滤。再用2 L含0.1% Na2SO3的蒸馏水冲洗滤渣，边冲洗边摇动滤布。滤液于4℃静止12h后倾去上清，将淀粉沉淀用蒸馏水洗三次。将淀粉平铺在滤纸上，自然晾干。将干燥的淀粉在研钵中研磨成粉，过100目筛，即得到马铃薯淀粉。

2.2.2 不同马铃薯转基因株系直、支链淀粉的分离

直、支链淀粉的分离纯化参照Lu等人[4]和Takeda等[5,6]的方法。具体步骤如下：

称取0.5 g马铃薯淀粉，加少量无水乙醇，使样品湿润，再加入 15 mL 0.5M NaOH，在沸水浴中搅拌 30 min，冷却，于 4 000×g 离心 10 min，去掉未分散物。用 2 M HCl 中和离心液，并加 10ml 体积比为1∶1丁醇-异戊醇，在沸水浴中加热搅拌 10 min，冷却至室温。移入冰箱内（2-4℃）静置 24 h，于 4 000×g 离心 20 min，沉淀物为粗直链淀粉，离心上清液为粗支链淀粉溶液。

将沉淀物全部移入饱和的 10 ml 正丁醇的水里，在沸水中加热至沉淀溶解，冷却至室温，置于 2～4℃冰箱中静置 2 h，于 4 000×g 离心 20 min，再将沉淀溶于正丁醇中，重复 2 次，离心得沉淀，用无水乙醇洗涤 2 次，于 50℃烘干，即得直链淀粉。

粗支链淀粉溶液加入 1 ml 辛醇，再加入 10 ml体积比为1∶1丁醇-异戊醇，在沸水浴中加热搅拌 10 min，冷却至室温，移入冰箱内（2-4℃）静置 48 h，于 4 000×g 离心 20 min，去掉沉淀物（残存直链淀粉），在离心上清液中加2倍体积无水乙醇，静置，离心，沉淀于 50℃烘干，即得支链淀粉。

2.2.3不同马铃薯转基因株系支链淀粉链长分布的测定

称取100 mg 分离的纯支链淀粉，加入2 mL0.5 mol/L NaOH后，置80℃水浴中加热搅拌10 min，冷却至室温后用1mL 1 mol/L HCl调整pH值至中性。然后加入2 mL异淀粉酶(5000U, 0.1mol·L-1醋酸钠缓冲液, pH 3.5)，于40℃水浴中反应24 h后（期间不时混匀），置沸水浴中10min终止反应。凝胶层析采用Sephadex G-75 层析柱（2.6 cm×80 cm），用0.05 M NaCl (含0.02%NaN3)进行洗脱，洗脱速率为20ml/h。上样结束后即开始收集样品，每30 min收集1管，每管即10ml。每管中的可溶性总糖的含量用苯酚-硫酸法测定[7]，还原性糖的含量用用 3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)进行测定[8]，每管中的平均链长用每管的可溶性总糖与还原性糖的比值来表示。

2.2.4 不同马铃薯转基因株系淀粉糊透明度的测定源-自/751+文,论`文'网]www.751com.cn

参照文献[9,10] 的测定方法。准确称取0.2 g的淀粉样品于50mL的离心管中，加水定容至20mL，配成质量浓度为1g/100mL 的淀粉乳，于沸水浴中加热糊化并搅拌20 min，保持淀粉溶液体积不变，冷却到室温，以蒸馏水作为空白对照(透光率设为100%)，在620nm波长下测定淀粉糊的透光率，重复3 次。

2.2.5 不同马铃薯转基因株系淀粉糊凝沉性的测定

参照文献[11]的测定方法。将100 mL 质量浓度为1g/100mL 的的淀粉糊放入量筒中, 在室温下静置, 24 h后记录沉降物的体积。以沉降物体积来表示糊的凝沉性质。

2.2.6 不同马铃薯转基因株系淀粉糊冻融稳定性的测定

称取1.8 g马铃薯淀粉样品于50mL离心管中，加蒸馏水定容至30mL（即配制成质量浓度为6 g/100mL的淀粉乳）。将淀粉乳于沸水浴中加热糊化并保30min(期间不时搅拌),保持淀粉糊的体积不变。冷却至室温，称取一定质量的淀粉糊（m1）于离心管中，置于-20℃的冰箱中冷冻24h 后，取出在室温下解冻，以3000 r/min的速度离心15 min，倾去上清液，称沉淀重（m2），计算析水率。每个样品重复三次。计算析水率(%)=(m1-m2)/m1×100。测定三次冻融循环的析水率[12,13]。