BIO ORGANS同源基因克隆及拟南芥转化(2)

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Keyword: Arabidopsis thaliana； BIO ORGANS gene； function research； organ size

摘要 I

Abstract I

1 前言 1

2 转百脉根BIO同源基因拟南芥的生长以及表型分析 2

2.1 材料与试剂 2

2.1.1 材料和菌株 2

2.1.2 主要试剂 2

2.1.3 主要仪器 2

2.2 实验方法 2

2.2.1 基因克隆 2

2.2.2 过表达载体的构建 6

2.2.3 过表达载体转化农杆菌 6

2.2.4 At4g32295和At3g24150转化拟南芥 6

2.3 结果与分析 7

2.3.1 特异性RT-PCR扩增和克隆载体酶切验证 7

2.3.2 表达载体的酶切鉴定和农杆菌菌落的PCR验证 8

2.3.3 转基因植株的分子鉴定 9

2.3.4 转基因植株表型分析 11

3 展望 14

参考文献 15

致谢 16

1 前言

百脉根(Lotus japonicus)又名五叶草（四叶草），豆科百脉根属多年生牧草，广泛分布于世界各国。百脉根营养含量极高，居豆科牧草的首位，收种后蛋白质含量可达17.46%[1]。其不仅含皂素低，适口性好，耐牧性强，不会引起家畜膨胀病，而且花量大、自花授粉[2, 3]，伞形花序，花器官呈独特的两侧对称方式，有内部对称的背部花瓣和不对称的侧、腹部花瓣[4]。BIO ORGANS(BIO)基因是在百脉根中克隆得到的，由染色体Ⅳ长臂上一个单一不完全显性位点调控，利用大规模EMS诱变得到的bio突变体中由于反转座子的插入，使得翻译提前终止，与野生型相比，花瓣内部不对称全部变为对称，器官增大[5]。导入BIO基因的烟草则明显矮化，器官变小，部分叶片缺刻或展现出一个叶片一分为二的趋势，花冠颜色变浅，花器官数目、大小、形态等方面均表现出了一定的变化[6]。BIO基因在豆科植物中趋于保守，因而推测其可能存在一个调控花器官大小和对称性的保守位点。

拟南芥（Arabidopsis thaliana）属十字花科，本身并无明显的经济价值，但拟南芥个体小，生命周期短，自花授粉，适于实验室内种植。作为植物界中第一个被完整测序的物种，与其他高等植物比，拟南芥的基因组很小，总共约1.15亿个碱基对，尽管如此，拟南芥中2.5万多的基因在功能类别上却与其他开花植物无甚差别[7]。拟南芥中有两个编号为At4g32295和At3g24150的基因，其碱基序列与百脉根BIO基因相似度非常高，推测其为BIO基因在拟南芥中的同源基因。At3g24150定位于细胞核，在植物体内广泛表达，而At4g32295有2种转录本At4g32295.1和At4g32295.2，定位于线粒体，At4g32295.1在植物保卫细胞中表达。

植物器官发育是一个极为复杂的生理生化过程，其中涉及大量特定调控基因的相互作用，更有传粉者、天敌、自然环境等多方面外部因素推动其表型的进化。近年来，随着研究的不断深入，大量调控植物器官表型的基因被鉴定和分离，使得植物发育的基因调控网络越来越清晰。目前尚未有针对LjBIO基因功能和调控机制的报道，也未见其同源基因拟南芥At3g24150和At4g32295的功能解析。鉴于此，我们希望通过模式植物拟南芥，克隆和研究BIO同源基因，考察其表达模式，探索其在调控植物生长发育中的具体生物学功能，以期反证百脉根BIO基因调控植物表型的分子机理与调控机制。本研究将开展的具体工作如下：