TGFBR2基因在徐淮山羊胎羊组织表达差异研究(3)

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主要实验器材如下：表1 相关实验器材

Table 1. Related laboratory equipmen

仪器名称型号生产厂家或地址

高速冷冻离心机

超净工作台

电热恒温水浴锅

Eppendorf移液器系列

紫外分光光度计

超低温立式冰柜

掌上离心机

电子天平

制冰机

PCR仪

微波炉

荧光定量PCR仪

台式高速离心机

电泳仪

普通冰箱 3-18K

SW-CJ-1B

21-6

200μL，100μL，20μL，10μL

NANODROP 2000C

MDF-382E

WTL

BP211D

FM70A

GeneAmp® PCR System 9700

WD700

CFX96

1-13

DYY-12型

BCD-257SL SIGMA公司

苏州

江苏常熟

德国

GBC公司

日本三洋

中国

德国Sartorious

中国格兰特

美国应用生物系统公司

佛山格兰仕公司

美国Bio-Rad公司

SIGMA公司

北京六一

海尔

2.2.3实验试剂

液氮、RNAiosplus（裂解液）、氯仿、无水乙醇、异丙醇、75％乙醇、RNase-free水、Taq酶、琼脂糖、TBE缓冲液、核酸染料、SYBR荧光染料、PCR试剂盒、反转录试剂盒：①gDNA Eraser ②5*gDNA Eraser Buffer ③prime suipt RT Enzyne mirl④5*prime suipt Buffer2 ⑤RT Prime mix ⑥RNase Free dH2O

2.3实验步骤

2.3.1提取组织块的总RNA[11,12]

（1）把镊子、剪刀、研钵等工具蘸上酒精并点燃杀菌，用实验托盘称取适量的样品加入冷却的研钵中并不断加入液氮进行研磨，直至粉末状之后加入1mL的 Trizol试剂。（如果标本的量超过Trizol容积的10%，就会使得DNA被污染）置于15-30℃环境温度下静置5分钟，目的是完全分离核蛋白复合体。（或-70°C过夜后再进行）

（2）将研钵里的样本移取到EP管中，用移液器反复吹打数次，室温静置5min，在高速低温离心机中离心（12000r/min，4℃)5min。

（3）离心管从离心机中取出后，取出另一小管，移取离心管中的上层水相，加入0.2mL的氯仿，将离心管的盖帽盖紧后双手猛烈摇晃15s（因氯仿具有沸点低易挥发的性质，所以应谨慎振荡离心管，防止盖帽因震荡过猛而弹开）。当离心管中的溶液乳化充分（无分层现象）后，在室温下静置5min之后离心16min。

（4）缓慢地取出离心管，由下往上观察到匀浆液共分为三层，依次为：下层为有色的有机物溶液、中间为乳状蛋白质层、上层为澄清液。移取上清液至另一灭菌离心管中（避免吸出中间层），加入同容积的异丙醇并缓慢吹打使其充分混匀，置于23℃恒温水浴锅中水浴加热10min后并离心10min。

（5）残留的在管的侧壁和底部的絮状胶样凝块，加入1mL75%乙醇溶解后离心5分钟，弃上清液留沉淀，室温下干燥沉淀。

（6）在沉淀中加入RNase-free水30mL，沉淀溶解后-80℃保存

2.3.2样品质量的检测

从组织中取出总的RNA样品使用紫外分光光度计、NanoDrop ND-2000C进行浓度检测。微量分光光度计测量260nm/230nm比值的吸收值，用于估测残留的有机溶；用于评估蛋白质污染比例则为260nm/280nm吸收值的比值。OD260/280测量结果在正常情况下应该趋近于2.0，若其数值小于1.8，则代表着存在着蛋白质污染的可能性，若大于2.2则可能是由于该样品RNA发生降解。此外，OD260/230 测量结果要保证高于2，如果这一测量数据没有达到2.0，则表明存在蛋白质被污染。