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1.4.3与GAL4品系杂交 4
1.5转基因果蝇品系的分子验证 5
1.5.1总RNA提取及cDNA第一链合成 5
1.5.2与目标基因相似的果蝇内源CYP基因搜索 6
1.5.3实时荧光定量PCR引物设计 6
1.5.4实时荧光定量PCR反应的体系和条件 6
1.5.5实时荧光定量PCR扩增效率的确定 7
1.5.6目标基因在不同果蝇品系中的相对表达量分析 7
2 结果与分析 7
2．1转基因果蝇品系的建立 7
2. 2 转基因果蝇品系目标基因的表达量分析 7
2.2.1实时荧光定量PCR引物的特异性分析 7
2.2.2实时荧光定量PCR产物扩增效率分析 10
2.2.3转灰飞虱CYP439A1V3果蝇品系中靶基因的表达量分析 11
2.2.4转灰飞虱CYP4C72果蝇品系中靶基因的表达量分析 12
2.2.4转灰飞虱CYP6CS2V1果蝇品系中靶基因的表达量分析 12
2.2.4转灰飞虱CYP6BD10V2果蝇品系中靶基因的表达量分析 13
2.2.4转灰飞虱CYP6F5JV2果蝇品系中靶基因的表达量分析 13
3 讨论 14
致谢 14
参考文献 15
5个转灰飞虱CYP基因果蝇品系的建立和定量PCR的验证
引言
灰飞虱Laodelphax striatellus(Fallén)属半翅目飞虱科，广泛分布于菲律宾至西伯利亚一带的亚洲和欧洲的温带稻区[1]。但是，由于目前化学杀虫剂大量的不合理施用，导致灰飞虱对新烟碱类、拟除虫菊酯类、有机磷类、有机氯类和氨基甲酸酯类等多种杀虫剂产生了抗药性[2]。因此，通过筛选以及验证灰飞虱与抗药性相关的解毒酶基因，从而揭示灰飞虱抗药性机理，研发出新的高效杀虫剂，对灰飞虱的防治具有重要的理论和实践意义。
研究表明，细胞色素P450s的功能具有多样性，不仅参与内源化合物例如保幼激素、蜕皮激素、信息素等代谢，还可以对多种外源化合物如杀虫剂、环境污染物、致癌物、植物毒素等进行代谢解毒，从而调控生物体的生理功能。如灰飞虱对噻嗪酮的抗性与CYP6CW1基因的过量表达相关[3]；棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性与CYP337B3、CYP6B7和CYP9A 家族成员上调表达有关[4-7]；褐飞虱对吡虫啉的抗性与CYP6ER1和 CYP6AY1的过量表达相关[8]，因此，昆虫细胞色素P450s对昆虫抗药性的形成起重要作用。
通过实验验证P450酶功能的常用方法有：蛋白体外表达和RNA干扰（RNAi）技术。其中，利用体外表达验证P450酶活性需要把细胞色素P450还原酶、细胞色素b5和P450酶共表达，重建一个完整的细胞色素氧化酶系，才能使P450酶展现催化活性，而且体外表达的P450酶活性很容易受到外界因素的影响；RNAi技术很难对靶标基因实现完全的沉默[9, 10]并且存在脱靶效应。因此，需要有其他方法能够有效地对解毒酶的功能验证提供补充和完善，本文采用的转基因果蝇超量表达技术即可以用来弥补蛋白体外表达研究中的不足。该方法利用ΦC31整合酶高效地介导外源基因与果蝇染色体上特定的attP位点的整合，然后利用GAL4/UAS系统实现靶基因在果蝇特定细胞、特定组织以及特定发育时期的超量表达，有效地验证解毒酶与杀虫剂代谢的关系。
本研究前期已经筛选到5个灰飞虱P450基因可能与杀虫剂解毒代谢相关，并已经成功构建转基因载体pUAST-attB-CYP6CS2v1、pUAST-attB-CYP6BD10v2、pUAST-attB-CYP439A1v3、pUAST-attB-CYP6FJ1v2和pUAST-attB-CYP4C72。因此，本文拟利用显微注射的方法将上述5个转基因载体分别导入果蝇胚胎中，构建获得了五个纯合的转基因果蝇品系，并通过果蝇GAL4/UAS系统，使目标基因在果蝇体内得到了超量表达，最后利用Q-PCR的方法进行靶基因的表达量验证，为进一步的解毒酶功能验证奠定扎实的基础。
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