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2.10 胞外蛋白酶酶活检测 21
2.11 生长曲线测定 22
3 讨论 23
致谢 24
参考文献 25
芽孢杆菌表达系统的筛选及改造
引言
芽孢杆菌表达系统是一种重要的外源基因表达系统，经改造后的芽孢杆菌，可以作为工业酶制剂的生产菌种。据统计，2013年时，世界上就约有50%份额的工业酶制剂是有芽孢杆菌或其外源表达系统表达生产的[1]。芽孢杆菌一般对人畜无致病性（除极少部分，如炭疽芽孢杆菌）。芽孢杆菌属1872年被首次提出，而其被人类利用的历史已有千年[2]。芽孢杆菌表达系统用以表达外源基因的优势在于：第一，大多数的芽孢杆菌为非致病菌，对人畜无害。第二，芽孢杆菌细胞壁的主要成分是肽聚糖和磷壁酸，分泌蛋白在细胞内加工完成后，直接被释放到细胞外，不会掺杂有糖类等难以分离的成分，因此，相对于大肠杆菌来说更易于分离。第三，芽孢杆菌有一套分泌信号肽以及分子伴侣系统，可以高效的表达分泌目的蛋白，可以分泌真核来源的重组蛋白。且其分泌的蛋白可以文持天然构象及生物活性。第四，芽孢杆菌生长环境简单，易培养，遗传背景清晰[3]。因此，在实验室和工农业生产中被广泛应用。例如，工业化的α-淀粉酶就是由芽孢杆菌生产的[4]。
当然，芽孢杆菌也具有一些缺陷，例如常用的枯草芽孢杆菌有如下缺点。第一，枯草芽孢杆菌在生长到对数期时会开始分泌一些胞外蛋白酶，这些包外蛋白酶对分泌蛋白的表达分泌会产生降解作用，从而导致胞外蛋白表达量下降或者不表达。第二，质粒不稳定性，尤其是在表达外源蛋白基因时会受到影响。第三，较难形成自发感受态，且文持的时间较短，天然菌株的分子克隆表达效率不高[5]。因此，针对枯草芽孢杆菌的第一个缺陷，本研究中以枯草芽孢杆菌168为原始菌株，对枯草芽孢杆菌中主要8个胞外蛋白酶进行了敲除。目前已有的胞外蛋白酶缺陷菌株WB800，能够把胞外蛋白酶的表达活性控制在0.1%以内[6]。但是由于敲除方法的原因，WB800中含有多个抗性残留，如hyg、ble等，会在利用此菌株作为表达载体的实验中产生一定的影响。因此，本研究中选取了WB800中敲除的8个主要胞外蛋白酶基因nprE、aprE、epr、bpr、mpr、nprB、vpr、wprA进行敲除，并采用无痕敲除的方式，不产生抗性残留。最终，获得了鉴定成功的8个胞外蛋白酶缺陷菌株。
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌是革兰氏阳性菌的模式微生物，长期以来在代谢工程和工业微生物领域中扮演了重要的角色[7]。枯草芽孢杆菌因其强大的分泌蛋白的能力和无毒性副产品的特性已经成为重组蛋白工业生产中重要的微生物[8,9]。本研究中，还采集了全国10余省市的土壤样品，对地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌进行分离纯化。地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），在土壤中广泛存在，通过地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌表达系统可以高效分泌很多水解酶类，因此大量应用于工业生产中[10]。我们希望在自然界中筛选到天然的菌株，希望能够对其进行改造，构建高效的外源基因表达系统。
1 材料与方法
1.1 材料及其培养
枯草芽孢杆菌168（Bacillus subtilis 168）株系，为实验室保存菌种。
全国十余省市土壤样品：北京、济南、厦门、成都、长沙、青岛、聊城、南京、重庆、合肥、杭州地区的土样样品。
温敏质粒（Temperature sensitive plasmid），名称为TA-20-SPC，为实验室保存，在芽孢杆菌细胞内30℃培养可增殖，经37度无抗性条件下过夜培养，丢失率在80%左右。本实验利用温敏质粒的这一性质，作为敲除菌株的筛选标记。
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