一般是以含有机溶剂的水相为流动相。流动相由水相(溶剂A)和有机相(溶剂B)混合而成。两种溶剂相互混合时释放出溶解的空气,如果产生的气泡带到泵中,输液泵则不能正常工作。流动相中溶解的气体还可能在LC系统低压端的检测器内产生气泡,引起假峰。因此,流动相或组成流动相的溶剂在使用前需要进行脱气。本次实验所用的流动相主要为配比60%的色谱甲醇和40%的水,pH为3.2的流动相配比(流动相的pH值不能超过色谱柱允许的pH使用范围。pH超出使用范围会导致硅胶基质流失和键合相碳链断裂,使得色谱柱的柱效下降,使用寿命变短),实验所用色谱柱为C18,色谱柱的安装一定要按色谱柱管上标示的流动相流向,将色谱柱的入口端用连接管和进样阀的出口连接起来,色谱柱的出口端则与检测器相连起来。
2.1.2 流动相的脱气、过滤和脱水
有机相通常是HPLC 级的甲醇或乙腈,在有机溶剂中溶解的气体较少,因此可不经过滤和脱气处理直接使用。从超纯水系统得到的水也无需过滤,但是水相含有原来是固体的溶质(如作为pH 缓冲剂的磷酸盐)时,必须过滤处理除去可能存在的颗粒物,滤膜的孔径一般为0.5μm。国内实验室大多采用抽真空过滤,同时完成溶剂的过滤和脱气。
高效液相色谱所使用的流动相在使用前都需要进行脱气处理,目的主要是为了除去其中溶解的气体,比如氧气,来防止洗脱过程中流动相重色谱柱到检测器的流动过程中,有气泡进入。因此,对流动相进行脱气可以使色谱泵的输液均匀准确,减小脉动;提高保留时间和色谱峰面积的重现性;防止进入气泡而引起尖峰;使基线走平,更稳定,提高信噪比;降低溶剂的紫外吸收本底;减少死体积以及防止填料氧化。在比较低的死体积检测池中,存在气泡会导致基线噪声的增加,严重时会造成分析灵敏度下降,而无法进行分析。
2.2 高效液相色谱仪的压力问题
压力是指示液相系统工作是否正常的重要依据,柱压问题是使用高效液相色谱仪过程中需要我们密切注意的地方,柱压的稳定与否会影响色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间。LC系统的压强大小和流动相的组成配比、柱填料的粒径和结构、流速等有关。在梯度洗脱的过程中,由于流动相组成的变化,以梯度运行为周期,压力呈规律性的波动。在等度洗脱的情况下,系统的压力应该保持在适当的大小,压力偏高、偏低或出现周期性的波动都是不正常的,柱压平稳缓慢的变化是允许的。一般压力过高都是由于堵塞所引起的,因此,为了确定堵塞的位置,应该对色谱仪进行逐步排除,从检测器开始,依次拧松连接检测器、色谱柱、柱前过滤器、进样阀、输液泵的接头,确认发生堵塞的组件或管道。
2.2.1 气泡导致的压力问题
泵体中有气泡会使压力偏低且不稳定,如果流动相已脱气处理过,那么气泡有可能来自低压管道一侧松动的接头处,确定完松动位置后,对AB泵进行重新排气处理即可将气泡排出;有时候由于疏忽,会导致储液瓶中的流动相耗尽或流动相低于阀口,使得空气进到输液泵内,系统压力下降,输液泵将停止工作,为了使LC系统恢复到正常状态,必须用流动相将连接管线、泵、色谱柱、检测器中的气体排出。在开始之前,断开输液泵出口处的连接,向储液瓶倒入流动相。打开输液泵的抽液排气阀,提升储液瓶高度,借助虹吸作用和连接在排气阀上的注射器,使输液泵进口管线充满流动相,在较高的流速下使泵运转几分钟后,关闭抽液排气阀,将输液泵与系统连接,在正常流速下冲洗,排除管道、色谱柱和检测器中的气泡。来`自^751论*文-网www.751com.cn