荧光双色同步响应检测技术(Two Color Coincidence Detection, TCCD)与FRET技术类似,都是通过检测标记在同一分子上两个不同荧光基团荧光强度的比值对单分子进行分析。其最早由Weiss等人[11]建立,利用两个荧光团的荧光强度之比进行单分子荧光检测,避免了激发光光源的不均匀性对实验结果所造成的影响。TCCD技术由部分重合的两个共焦区域组成,将两种不同的发射波长分离,用雪崩光电二极管(APD)对分子上两个荧光团的荧光信号进行分别检测[12]。与FRET技术相比,该技术一个突出的优点是:TCCD法使用两束独立的激光对两个荧光团进行分别激发和检测,这就允许了将两个荧光团标记在生物分子上任何合适的位置,避免了FRET法所受到的空间距离的限制[13],极大地简化了标记过程。
目前TCCD法已被用于蛋白质-RNA相互作用、蛋白质折叠、RNA二聚作用、病毒组装等[14]多方面的研究中。
二、使用单分子荧光技术研究端粒传感器
生物传感器是一种十分有效的DNA序列检测途径,其种类繁多,其中一种广泛应用的方法是表面实验[15,16],该方法将酶、抗体、DNA探针等固定在表面(如酶电极、DNA微阵列等)上。生物传感器包含两个主要因素:传感装置与识别元件。识别元件包括两个亲和配对伙伴(抗体/抗原,酶/底物,受体和其特异性配体,或活细胞和分析物特异性结合),它们其中之一是被固定的。
富G DNA单链(如端粒3’端的富G悬突)可折叠成一种G-四联体的二级结构,这种结构影响端粒和端粒酶的结合,抑制了端粒酶的活性,破坏了端粒长度和结构的文持,从而阻碍了癌细胞的永生,因此,G-四联体结构有希望作为靶点应用于新型抗癌药研发,有着极为重要的研究和应用价值。当G-四联体结构形成后,富G DNA序列两端距离明显变短,而当其展开时,其两端距离增长。因此,可利用端粒G四联体结构变化的特性,在端粒DNA序列两端分别标记两种不同的荧光团分别作为供体和受体,建立FRET体系,当G-四联体结构变化时,供、受体之间距离发生改变,体系FRET信号随之发生相应变化,根据这一原理可设计出一种端粒传感器,用以检测与G-四联体DNA序列互补的靶DNA[17~18]。
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