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    Physica MCR301流变仪    奥地利安东帕公司;
    MUL-9000系列纯水机    美国密理博公司。
    1.3   实验方法
    1.3.1   肌原纤文蛋白的制备
        冷鲜鸡胸肉购于南京苏果超市,去除肉眼可见的脂肪和结缔组织,切碎后称质量。参照韩敏仪等[8]人的提取方法于0~4°C条件下提取肌原纤文蛋白。使用三种提取缓冲液(缓冲液Ⅰ:25mM NaCl、5mM EDTA Na2、5mM Tris-HCl、pH7.5;缓冲液Ⅱ:0.1M NaCl、5mM EDTA Na2、5mM Tris-HCl、pH7.5;缓冲液液Ⅲ:2.5mM NaCl、5mM Tris-HCl、pH7.5)进行提取,具体方法如下:
        取切碎好的鸡胸肉称重,假设为100g,使用组织绞肉机绞碎:绞碎速度为7000rpm,绞碎总时长为60s,注意每10s 暂停一次,避免机器运行产生的热量对肌原纤文蛋白产生不利影响。绞碎后加入1L缓冲液Ⅰ,使用高速匀浆机匀浆3min,每30s 停一次,在10000g条件下离心10min,弃上清,收集沉淀;加入0.5L缓冲液Ⅱ与收集的沉淀混合,再加入Triton X-100使其含量为0.5%,匀浆机匀浆1min,在10000g条件下离心10min,收集沉淀;加入0.5L缓冲液Ⅱ与沉淀混合,匀浆30s,过三层纱布,在10000g条件下离心10min,收集沉淀;加入1L缓冲液Ⅲ,匀浆30s,在10000g条件下离心10min,收集沉淀,即得肌原纤文蛋白。
        以牛血清蛋白作标准曲线,用双缩脲法测定蛋白质浓度,最后用磷酸缓冲溶液(0.6 M KCl、20 mM K2HPO4、20 mM KH2PO4、pH 6.5)稀释蛋白至浓度为20 mg/mL。将样品分装于100mL烧杯中,储存于4°C冰柜中,在一周内使用完。
    1.3.2   超声处理
        参照Li等[5]的方法。称量60g样品分装于100mL烧杯中,另在烧杯外层套着装有冰水混合物的500mL烧杯。选用VC 750超声波细胞破碎仪进行超声处理,其操作条件为:输出功率750W、超声波频率20kHz、振幅60%、超声强度28-32 W/cm2。超声脉冲总共作用6min,超声时,探头(d=13mm)深入液面1.5cm,超声脉冲过程中工作时间和间歇时间分别为2s和4s。同时超声每隔30s需手动搅拌一次,保证样品均匀,控制样品温度在4~10°C。超声后于4°C冰柜保存。
    1.3.3   超高压处理
        参照Xue[9]等的方法。取30g样品分装于聚乙烯包装袋中,使用塑料薄膜封口机进行塑封,避免气泡。将样品放入在0.3L容量的850 Mini Food Lab高压容器高压容器(Stansted Fluid Power Ltd.,UK)中进行超高压处理。选择超高压处理参数为200MPa,9min。同时使用丙二醇和蒸馏水(30:70)的混合物作为压力转移介质,并通过热熔夹套将介质温度控制在25°C。超高压处理结束后立刻放入冰水混合物中冷却,而后放置于4°C冰柜备用。
    1.3.4   高压均质处理
        参照Chen[10]等的方法,使用装备有增压器以及75μm开放的Y型金刚石喷嘴的高压均质机对样品进行处理。高压均质机管道入口温度为4°C,样品在15000psi的恒定压力下通过,为保持出口温度能下降到20°C以下,需在出口管道外添加快速冷却系统,通过两次后即得样品,放置于4°C冰柜中保存。
    1.3.5   测定前处理
        分别取未经处理、超声处理、超高压处理、高压均质处理的6g样品加入10mL离心管中,避免产生气泡。放置水浴锅中,以1°C/min的升温速率将样品从25°C加热到75°C,并在75°C保温15min,结束后取出置于4°C低温室内过夜。准备第二天进行测量蒸煮损失和离心损失;用滴管吸取经不同非热加工技术处理后的6g样品放入10ml烧杯中,进行上述相同的蒸煮过程,准备第二天测量凝胶强度、T2弛豫特性。剩余样品则继续保存于4°C冰柜中,待进行流变特性、蛋白溶解度、活性巯基含量、表面疏水性等参数的测定。
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