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1.2.5 影响DNA在金电极表面固定的因素
由于DNA为生物活性大分子，极端的环境或者操作不当极易影响其活性，而DNA生物传感器的灵敏度与DNA探针在电极上的生物活性密切相关。很多因素都会影响到DNA的固定效果，例如溶液PH，温度,离子强度，探针本身的性质，固定的时间等。
（1） 溶液pH对探针DNA固定的影响：Wrobel等【11】对氨基修饰DNA探针进行放射性标记，直接研究了影响氨基修饰探针在羧基修饰金表面固定的因素。固定离子强度（0.5mmol/L磷酸盐缓冲液），变化pH的实验结果显示，当pH从酸性（pH 2.2）上升到中性（pH 6.9）时，DNA在金表面的非共价吸附量降低约2.5倍，但pH继续升高（pH 9.4），吸附量没有明显变化。从以上研究可以看出，偏酸性的环境有利于探针在金表面的固定，而中性条件下固定的探针杂交能力最强，因此，绝大多数研究者选择在中性左右的环境中固定探针。
（2） 温度对探针DNA的固定的影响：由于DNA生物在过高的温度中易发生空间构象的变化，影响其结合和检测的效率，故探针DNA的固定不能在过高的温度中进行；相反，过低的温度也会影响探针的活性，而且使结合到电极表面的效率大大降低。一般实验中，都把保持在常温下进行。
（3） 离子强度对探针DNA固定的影响：Wrobel等【11】固定pH，研究离子强度对氨基修饰DNA在羧基修饰金表面物理吸附的影响，结果显示，1mol/LKCl中DNA在金表面的吸附量是10mmol/LKCl中的约2倍，因为离子强度的增加削弱静电相互作用，因此有较高的DNA吸附。但在共价固定中，与较低离子强度（10mmol/LKCl）固定液比较，通常推荐使用的高离子强度的固定液（1mol/LKCl）只对固定有很小的改善作用。离子强度的增加有利于探针的固定，一般使用的离子强度在0.01-1之间。
（4） 探针DNA本身性质的影响：自身性质的影响主要包括两个方面，一个是探针DNA的长度，一个是探针DNA的溶度。对于同一种DNA探针，DNA的固定量随链的长度增加而减少。导致这个现象的原因可能是长链探针上有多个点笃定在电极表面，使一个DNA在电极表面占据了较大的面积，影响了固定量。刘明华等【12】研究表明，金表面巯基修饰的DNA探针固定量随DNA溶度的增加而增加。这是由于溶度的增加使金硫键的形成更加容易，反应平衡向正反应方向移动。但是当DNA探针达到一定的溶度后，结合量反而降低，这可能与DNA的空间排列结构和DNA分子间的静电排斥有关。
1.3 电化学生物传感器的表征
1.3.1 探针DNA在金电极表面组装的表征方法
在探针DNA链的5’端修饰巯基，利用金硫键将探针DNA组装到金电极表面，与待测DNA进行杂交。因而，DNA探针在电极上的组装是制备DNA电化学生物传感器的关键。下面简要的介绍两种检测DNA在金电极表面组装的表征方法。
一、伏安法检测
探针DNA在金电极上的组装情况可通过对组装前后金电极的伏安信号的差异进行检测【25】。如图4所示，裸金电极和经过HS-ssDNA组装的探针电极在0.5mol/L的KCl的伏安信号进行对比。结果发现，在通氮除氧前，裸金电极上的还原峰Ⅰ电流强度较大，除氧后与探针电极相比，增长幅度明显减小。这说明峰Ⅰ的产生与氧有关。相同条件在HS-ssDNA修饰的探针电极上，峰Ⅰ则基本消失，这是由于电极表面DNA自组装膜的形成阻碍了氧在电极表面的电子传递。同时，探针电极在-0.9V左右产生乙硫醇的特征峰Ⅱ，说明巯乙基修饰的ssDNA已经通过自组装固定在金电极表面。
图4 裸金电极A和组装HS-ssDNA的金电极B的伏安曲线
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