内切葡聚糖酶基因egl2在巴斯德毕赤酵母中的表达(2)

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3.2.1 目的基因egl2的获取 15

3.2.2 基因egl2的回收 16

3.2.3 大肠杆菌重组子质粒检验 16

3.2.4 重组子线性化验证 17

3.3 重组毕赤酵母的筛选和鉴定 17

结论 21

参考文献 22

致谢 24

1 前言

1.1 纤维素酶概述及动态研究

纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，在食品、饲料、医药、纺织、洗涤剂和造纸等工业领域有广泛的应用价值[1]。纤维素是当今可再生利用的能源之一，是自然界分布最广，含量最多的一种多糖。纤维素可以用纤维素酶降解，一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木霉属(Trichoderma)、曲霉属（Aspergillus）和青霉属(Penicillium）。目前，能源短缺问题已经成为制约经济社会的持续发展的关键，人类开始积极探索可代替的新能源[2]。同时纤维素酶在食品行业和环境行业均有广泛应用。而纤维素酶用于纤维素的降解，可以为糖能源的利用提供更便捷的方式，在工业生产中酒精发酵时，纤维素酶的添加可以增加原料的利用率，并对酒质有所提升。由于纤维素酶难以提纯，实际应用时一般还含有半纤维素酶和其他相关的酶，如淀粉酶（amylase）、蛋白酶（Protease）等。论文网

纤维素酶种类繁多，来源很广，不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大。纤维素酶系是一类由降解方式不同的3类酶组成:(1)内切葡聚糖酶(endol，4-p-Dglucaiiase， EC3.2.1.4，简称EG或称为Cx 酶);(2)外切葡聚糖酶(exol，4-p-Dglucanase， EC3.2.1.91，简称 CBH或称为 C1 酶); (3)β-葡萄糖苷酶(p-glucosidase，EC3.2.1.21，称 BG 或纤维二糖酶)，三种酶通过协同作用降解纤维素[3]。

由于真菌纤维素酶产量高、活性大，故在畜牧业和饲料工业中应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。故纤维素目前主要研究用于工业食品生产的领域。而前段时间中央电视台主持人柴静就雾霾发表的采访录《苍穹之下》引起了社会广泛的关注，雾霾的主要来源之一为秸秆等农作废弃物的无处理燃烧，农作物的主要成分为纤维素，若能利用一定的手段将废弃农作物进行预处理成为工业生产的原料那在能源节约和环境方面都有益处，基于这一出发点，在导师的指导下进行了相关纤维素酶（内切葡聚糖基因）的分子研究。

1.2 里氏木霉概述

产纤维素酶的霉菌菌种有木霉属、根霉属和曲霉属等[4]。木霉属真菌分泌的纤维素酶系更加全，产量更加高，而且还能分泌到胞外[5]。里氏木霉（Trichodermareesei）是多细胞的真核微生物，红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性型,隶属于丛梗孢目（Moniliales）木霉属（Penicillium）。里氏木霉所产纤维素酶和半纤维素酶包括:内切葡聚糖酶I (EGI)、EG II， EG III，外切纤维素酶I (CBHI)、CBH II，木聚糖酶I (XYLI)，XYL II， β-木糖苷酶，a-L阿拉伯呋喃糖酶，乙酰基木聚糖酯酶，甘露聚糖酶，半乳糖苦酶，木葡聚糖酶，聚半乳糖醛酸酶，内切β-l，3葡糖苷酶[6]。在里氏木霉分泌的高效且大量的纤维素酶中，胞外纤维素酶系内，外切葡聚糖酶占60%-80%，内切葡聚糖酶占20%-36%，β-葡聚糖苷酶占1%，它们协同作用于纤维素使之降解成葡萄糖[7]，内切酶为主要的纤维素酶。