淮安紫薯多酚氧化酶的性质研究(2)

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2 材料与方法

2.1 实验材料

淮安紫薯，2014年3月购买于淮安市王营菜市场。紫薯购买回以后立即运回实验室，并且将之放置于4℃冰箱中冷藏保鲜。

2.2 实验仪器

722S型可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司；TGL-16型高速冷冻离心机北京长流科学仪器公司；PHS-3C型pH计上海仪电科学仪器股份有限公司；YP1201N型电子天平上海精密科学仪器有限公司；HH-S型恒温水浴锅金坛市亿通电子有限公司；WH-3型微型漩涡混合仪上海沪西分析仪器厂有限公司。

2.3 测定方法

2.3.1 多酚氧化酶（PPO）的提取

紫薯多酚氧化酶的提取过程均在0～4℃条件下进行。所用缓冲液为磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液（0.05mol/L，pH6.7）。

首先取新鲜紫薯洗净、去皮、切碎，称取100g。而后将100g已切碎的紫薯放入高速组织捣碎机中，加入一定量的磷酸缓冲液研碎、打浆。其次将匀浆后的紫薯放入冷冻离心机中以12000r/min离心30min。然后取上层清液加入一定量体积的冷冻丙酮，再以9000r/min冷冻离心15min。最后取其上清则为紫薯多酚氧化酶粗酶液。

2.3.2 多酚氧化酶（PPO）工作波长的选择

首先，取两支试管分别加入1ml邻苯二酚、2ml的pH为6.7的磷酸缓冲液0.5ml粗酶液，其中一支试管中以0.2ml蒸馏水代替粗酶液作为空白管对照，混匀后放入35℃水浴锅中预热10min，然后在可见分光光度计下测取粗酶液的吸光值,每隔5min读取OD值。

2.3.3 多酚氧化酶（PPO）的活性测定

首先取两支试管，吸取pH6.7的磷酸缓冲液2ml于两试管中，于一支试管中加入1ml邻苯二酚溶液作为底物，于另一支试管中加入1ml水代替邻苯二酚，然后分别在两支试管中加入0.2ml的粗酶液，混匀后在30℃的水浴锅中预热，采用分光光度法测波长为410nm处的吸光值，每间隔30s读取OD值。酶活力单位定义为：在测定条件下，酶活力以每分钟OD值改变0.001为1个酶活力单位（U）[4]。