ACTC1基因在徐淮山羊胎羊组织表达差异研究(3)

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2.2.2仪器设备

表2-1 仪器设备

Table 2-1 The instruments and equipments

仪器名称型号生产厂家或地址

高速冷冻离心机

超净工作台

电热恒温水浴锅

Eppendorf移液器系列

紫外分光光度计

超低温立式冰柜

掌上离心机

电子天平

制冰机

PCR仪

微波炉

荧光定量PCR仪

台式高速离心机

电泳仪

普通冰箱 3-18K

SW-CJ-1B

21-6

200uL，100uL，20uL，10uL

NANODROP 2000C

MDF-382E

WTL

BP211D

FM70A

GeneAmp® PCR System 9700

WD700

CFX96

1-13

DYY-12型

BCD-257SL SIGMA公司

苏州

江苏常熟

德国

GBC公司

日本三洋

中国

德国Sartorious

中国格兰特

美国应用生物系统公司

佛山格兰仕公司

美国Bio-Rad公司

SIGMA公司

北京六一

海尔

2.2.3 试剂

无水乙醇、DEPC-超纯水、RNAiso Plus（裂解液）、氯仿、NaCl、液氮、异丙醇、PCR定量试剂盒、琼脂糖

反转录CDNA试剂盒：①gDNA Eraser ②5*gDNA Eraser Buffer ③prime suipt RT Enzyne mirl ④5*prime suipt Buffer2（for real time） ⑤RT Prime mix ⑥RNase Free dH2O⑦Easy Dilution(for real time PCR)

2.3方法

2.3.1提取的各组织的总RNA[11,12]

(1) 向研钵、剪刀、镊子等沾取少量酒精点燃灭菌，加入液氮冷却。迅速加入适量山羊组织样品并不断倒入液氮至研磨成粉末。

(2) 加入1 mL的裂解液，盖上锡箔纸，静置30min。将样本移去1.5 mL EP管中，冰盒静置5 min。设置高速冷冻离心机温度为4℃，转速12,000 r/min,离心5min。

(3) 取出上清液移到EP管中，加入0.2mL氯仿，盖紧离心管，用力振荡15s，等到溶液充分乳化，称重配平，在冰盒静置5 min，离心16 min。

(4) 取出上清液到新管中，加入等量的异丙醇，充分混匀后称重配平。在23℃恒温锅水浴10min，最后离心10min。

(5) 留下白色沉淀，顺着离心管徐徐加入1 mL 75%的乙醇，轻柔的洗涤离心管壁。离心5 min，弃去所有乙醇。

(6) 室温下干燥沉淀5 min，加入RNase-free dH2O，慢慢地用移液枪吹打，至沉淀完全溶解，放在-80 ℃冰箱中保存。

2.3.2 检测提取出的RNA的浓度

用紫外分光光度计（Cintra）来进行RNA浓度检测。使用后用超纯水洗涤3次。OD260/280值应该在1.8-2.0之间，假如R小于1.8则蛋白质可能被污染，大于2.2则RNA可能已经降解。同时，OD260/230 要大于2.0、小于2.4，假如低于2.0则裂解液中有机溶剂可能没有去除干净。如果实验结果不符合上述要求，要重新提取RNA。

2.3.3 RNA逆转录成cDNA

（1）反转录前，把DNA酶加入提取的RNA中，去除基因组的DNA。

（2）配置反应液：一般为了减少误差要做多组实验，反应液量配置要多于实际量。反应液的成分如下：②5*gDNA Eraser Buffer 2.0uL ;①gDNA Eraser 1.0 uL ; Total RNA 最多1ug ; ⑥RNase Free dH2O 加到10.0uL.

（3）把反转录仪温度升到42℃，把配好的反应液静置2分钟。

（4）配置Master Mix：把参与反应的混合液配好放在冰上，我们要按多于反应数2的量配制Master Mix，然后等量分到反应管中。Master Mix溶液成分如下：③Prime Script RT Enzyne Mix 1.0uL ;⑤RT Prime Mix 1.0uL ; ④5xPrime Script Buffer2 4.0uL ; ⑥RNase Free dH2O 4.0uL ;