奶牛CSN1S1基因克隆及其可变剪接体的鉴定与分析(2)

菜单

图2-3 CSN1S1基因可变剪接体示意图

表清单

表序号表名称页码

表1-1 CSN1S1基因克隆所用引物 3

表1-2 反转录的反应体系 4

表1-3 反转录的反应条件 4

表1-4 CSN1S1基因编码区序列的PCR反应体系 5

表1-5 CSN1S1基因编码区序列的PCR反应条件 5

表1-6 pMD19-T载体连接体系 6

表1-7 菌液PCR反应体系 6

表1-8 菌液PCR反应条件 6

引言

牛奶是我们重要的日常饮品，然而奶牛的泌乳性能又是奶牛最为重要的生产及经济性状，因此提高奶牛的泌乳性能，增加奶牛的产奶量，对奶牛行业具有重要的经济意义。牛乳中所占比例最大的蛋白质为酪蛋白，约占80%，除了酪蛋白，乳清蛋白和少量的非蛋白氮也是牛乳中主要的蛋白质 [1]。酪蛋白包含αs1-酪蛋白(CSN1S1)、β-酪蛋白(CSN2)、αs2-酪蛋白(CSN1S2)以及k-酪蛋白(CSN3)， CSN1S1，CSN1S2，CSN2和CSN3依次为αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、αs2-酪蛋白以及k-酪蛋白的编码基因。四者紧密连锁在牛的第6号染色体长臂的31区—33区，该区段大小约250 kb，四个基因在染色体上的排列顺序依次为CSN1S1－CSN2－CSN1S2－CSN3。在四个基因编码的蛋白质中，CSN1S1编码的αs1-酪蛋白占到乳中总酪蛋白含量的40%以上[2]。

查阅现今的文献资料、美国生物技术信息中心可知，牛αs1-酪蛋白基因（CSN1S1，AC_000163）全长17607bp，其中该基因含有19个外显子，大小在24—385bp，约占1173bp；含有18个内含子，长度约为90—1962bp，占16434bp。外显子与内含子长度比例为1：14.0，尽管其编码区突变率较高，但侧翼序列比较保守[3]。

研究表明，人体必需氨基酸为人体本身无法生成，必须从外界营养物质中摄取，以供人体的成长、维护及保养等生理发展。然而酪蛋白为人类所提供的营养物质中包含了人体必需氨基酸[4]。活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能：易消化吸收；有促进人体免疫、抗菌、抗病毒、激素调节、降血压和降血脂等作用；具有较高的食用安全性，是当前极具发展前景的功能因子。据此了解，生物体内活性肽的主要来源即为牛乳中的酪蛋白。酪蛋白基因中含有多种活性序列，它们大多以以无活性形式存在。只有经过合适的蛋白酶水解，释放出来之后，才能成为具有生理活性的肽段，对人体的消化和代谢起着重要的调节作用。例如促进矿物质吸收肽主要是动物乳中酪蛋白αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白中经胰蛋白酶作用后制得的酪蛋白磷酸肽（CPP），具有促进小肠对钙、铁和其他矿物质元素吸收的功能，可用于幼儿、老年食品和耐乳糖过敏的酸奶等产品 [5]。由此可得，CSN1S1基因编码了牛乳中重要的蛋白质，而且该基因在乳腺组织中是否准确表达以及表达量的多少将会直接影响牛乳中蛋白质的组分、含量和质量，从而对乳品质产生影响。

可变剪接(alternative splicing, AS)是目的基因的mRNA前体分子通过多种形式的RNA剪切过程，然后重新组合连接形成mRNA即不同的剪接异构体。最终产生多种不同的成熟mRNA的过程[6]。在该过程中，由于多种剪接因子和基因调控元件的相互作用，相关外显子会缺失或者部分残留，内含子也会发生不同程度的残留等，形成各种形式的组合，由此会有多种mRNA翻译成多种相应的蛋白质[7]。据报道，CSN1S1基因存在有多种可变剪接体。因此，在该基因转录表达的过程中会产生多种成熟的mRNA，可翻译成为多种蛋白质。由此可见，CSN1S1的可变剪接过程对牛乳品质具有重大的影响。