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1.2 基因结构与蛋白序列特征分析
为绘制脊椎动物酪氨酸酶基因的结构，获取这些基因的基因组序列和编码序列是前提基础。通过对基因组序列与编码序列进行比较，可以推知这些基因的外显子/内含子的个数与组成模式。在设置参数默认条件下，脊椎动物酪氨酸酶基因的结构由GSDS 1.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)绘制完成[13]。脊椎动物TYR蛋白均具有典型的功能结构域Tyrosinase,为更加详尽地剖析TYR蛋白的序列特征，本研究利用MEME 工具(http://meme.nbcr.net/meme4_1/cgibin/meme.cgi)对脊椎动物TYR蛋白的保守基序进行分析[14]。参数设置如下：同一保守基序在一条序列中出现的次数为0或者1, 保守基序长度范围6~200个氨基酸残基, 基序最大发现数目20个, 剩余参数均为默认值。此外，针对脊椎动物酪氨酸酶保守基序与功能结构域进行了比较，对其相互重叠情况进行了分析。
1.3 蛋白序列比对与系统进化分析
脊椎动物TYR蛋白序列的多重比对分析由本地化的Clustal X软件完成，其主要参数设为默认值[15]。对序列多重比对结果进行手工调整后，进一步提交到MEGA软件，在默认条件下，采用邻接法(Neighbor-Joining Method)构建系统发生树[16]，其进化树图的输出由MEGA软件完成[17]。
1.4 选择压力检测与蛋白结构模拟
选择压力检测常要用PAML(http: //abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.html)软件包中的CODEML程序[18]。CODEML程序运行除了控制文件外，还必须至少需要密码子比对文件(PAML格式)和树文件(Phylip格式)。为准备密码子比对文件，编码序列与蛋白序列均被下载，并且Clustal X软件对蛋白序列进行比对分析，然后，在氨基酸比对结果的指导下由编码序列转化为密码子比对序列，这个转化过程由Pal2Nal在线服务器完成[19]。同时利用密码子比对结果产生相应的进化树，其过程由TreeView完成[20]。选择压力检测出EcTYR和SsTYR祖先基因分支，SsTYR基因分支以及GgTYR和TgTYR的祖先基因分支均发生快速进化，相应的正选择位点被鉴定。为阐明这些正选择位点在TYR蛋白三文结构中的分布，对EcTYR、GgTYR和SsTYR蛋白进行同源建模，其详细计算和模拟过程均由EasyModeller工具完成[21]。最后，利用PDBpaint工具将正选择位点定位于三个TYR代表性蛋白结构上[22]。
2 结果与分析
2.1 脊椎动物酪氨酸酶的系统进化分类
为探明脊椎动物酪氨酸酶的系统进化关系，搜索与收集代表性脊椎动物酪氨酸酶是首要工作。基于UniProt(www.uniprot.org/)、NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Ensembl(www.ensembl.org/)数据库，以已知人酪氨酸酶基因为探针，利用BLAST工具在人、鸡和斑马鱼等脊椎动物基因组中搜索直系同源基因。若在同一个基因组存在多个同源基因，将保留最佳匹配基因，构建脊椎动物直系同源基因类群，这个类群共包括17个TYR基因。为进一步确证这些基因是酪氨酸酶基因，Pfam在线工具分别被用于鉴定脊椎动物酪氨酸酶的功能结构域。结果表明，17个TYR蛋白均包含典型的Tyrosinase (PF00264)结构域，这说明这些蛋白是酪氨酸酶。此外，17个脊椎动物TYR基因的物种来源、基因名称、Ensembl登陆号以及基因组匹配区被详细列出(表1)。
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