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    3.结论与讨论    12
    参考文献    14 引言
       黑色素是一种广泛存在于动物、植物和微生物的生物色素，主要分布于人类或动物的皮肤、粘膜、视网膜与胆囊等部位，与人类白化病、皮肤癌以及白癜风等疾病密切相关[1-2]。目前，模式生物黑色素生物合成已被阐明，其大致过程为：在黑色素细胞中，酪氨酸经酪氨酸酶作用，羟化生成多巴，后者经氧化、脱羧等反应转变成吲哚醌，最后吲哚醌聚合为黑色素。酪氨酸酶(Tyrosinase, TYR)是一个含铜的氧化还原酶，它也是生物体中黑色素合成的关键限速酶[3]。酪氨酸酶属于III型铜蛋白超家族，同时这个超家族还包括酪氨酸酶相关蛋白、儿茶酚氧化酶和血蓝蛋白[4]。酪氨酸酶与酪氨酸酶相关蛋白具有较高的同源性，故而这些蛋白形成了酪氨酸酶相关蛋白基因家族，这个家族共包括三个成员：酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶关联蛋白1(TYRP1)和酪氨酸酶关联蛋白2(TYRP2)[5]。尽管TYRP1和TYRP2蛋白参与黑色素生物合成，与动物毛色具有某种关联，但目前仍然认为TYR才是黑色素合成的关键酶，是决定动物毛色的重要基因。近年来，越来越多的证据支持酪氨酸酶是黑色素合成限速酶这一结论。Yokoyama等人以白化鼠为材料研究TYR基因时发现，TYR蛋白中Cys突变为Ser是鼠白化病发生的主要原因[6]。Pomerantz等和Iwata等通过试验证明，黑色皮肤组织的酪氨酸酶活性高于白色皮肤组织[7-8]。研究人员将正常的酪氨酸酶基因转移到白化鱼体内，转基因鱼的体色得到不同程度的恢复[9-10]。此外，已有研究证实，TYR基因的表到水平与动物毛色具有紧密关系，表现出一定的正相关[11-12]。
    以前对TYR基因的研究主要集中在酪氨酸酶突变与毛色之间关系，酪氨酸基因表达水平，酪氨酸酶活性及其功能等方面。但是关于该酶在脊椎动物中的进化模式研究较少，尤其从单个氨基酸水平检测快速进化位点工作未见报道。本研究以脊椎动物酪氨酸酶为对象，基于生物信息学手段首次系统地剖析了脊椎动物该酶基因的结构、保守基序、功能结构域、蛋白三文结构以及选择压力等。这些研究为进一步研究酪氨酸酶的功能及其活性位点，为进一步探索黑色素生物合成机制奠定了基础。
    1 材料与方法
    1.1 物种抽样与酪氨酸酶序列获取
    为研究脊椎动物酪氨酸酶的序列、选择压力以及结构模型，17种代表性脊椎动物被选为研究对象，这些物种包括人(Human, Homo sapiens)、黑猩猩(Chimpanzee, Pan troglodytes)、负鼠(Opossum, Monodelphis domestica)、马(Horse, Equus caballus)、小鼠(Mouse, Mus musculus)、褐家鼠(Rat, Rattus norvegicus)、猕猴(Macaque, Macaca mulatta)、猪(Pig, Sus scrofa)、鸭嘴兽(Platypus, Ornithorhynchus anatinus)、热带爪蟾(Frog, Xenopus tropicalis)、斑胸草雀(Zebra finch, Taeniopygia guttata)、鸡(Chicken, Gallus gallus)、红鳍东方鲀(Fugu, Takifugu rubripes)、金娃娃(Tetraodon, Tetraodon nigroviridis)、青鳉(Medaka, Oryzias latipes)、三刺鱼(Stickleback, Gasterosteus aculeatus)和斑马鱼(Zebrafish, Danio rerio)。
    为获取上述17种脊椎动物的酪氨酸酶基因的基因组序列、编码序列和蛋白序列，本研究以人酪氨酸酶基因为检索序列，利用BLAST或BLASTP工具搜索NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，UniProt(http://www.uniprot.org/)和Ensembl(http://www.ensembl.org/)等数据库，最终获取这些脊椎动物酪氨酸酶基因的相关序列。具体步骤为：1）先获取基因的蛋白序列(UniProtKB/Swiss-Prot登陆号，P14679)，利用BLAST搜索NCBI数据库，获得候选酪氨酸酶基因的序列；2）利用Pfam(pfam.sanger.ac.uk/)工具分析候选蛋白的功能结构域，含有Tyrosinase (PF00264)结构域的候选蛋白被认定为TYR蛋白；3）当同一物种有多个TYR蛋白时，选取同源性最高的TYR蛋白作为代表，进行下游研究；4）将这些TYR基因的蛋白和cDNA序列以FASTA格式保存，以备下一步分析。
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