苦苣菜黄网病毒P基因的克隆及原核表达(3)

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1.1.2 外源基因高效表达的影响因素

大肠杆菌的优点众多，但并不能有效表达所有基因。这是由于外源基因本身特性和表达系统的特性及其他因素对外源基因高效表达的影响。

1.1.2.1 外源基因本身的特性对表达的影响

1.外源基因包括原核基因和真核基因，由于自身的特性，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，相反，真核基因需以cDNA形式在大肠杆菌中表达。

2.外源基因密码子的选择也影响着外源基因的高效表达。

3.RNA的一级与二级结构的影响：mRNA一级结构对翻译效率的影响已有较多的研究。有报道认为间距以6-11个碱基为最好，而碱基组成C+G比例不超过50%为好[5]。另外，降低翻译起始区（TIR）二级结构稳定性有利于外源基因表达[6]。

1.1.2.2 表达系统的特性对表达的影响

1.表达载体的选择：表达系统的核心是表达载体。比如，外源基因若要在大肠杆菌中进行表达，其载体应满足许多要求：适用范围广、表达产物易纯化、在菌体内稳定性好、表达产量高等。

2.启动子的结构：大多数大肠杆菌启动子都含有- 10 区和 -35 区两种保守区。研究表明，启动子的这两个区域与上述保守序列的相似程度越高，该启动子的表达能力也就越强。另外，这两个保守区间的距离也是影响启动子强度的重要因素，即这个间距越是接近于 17 bp，启动子的活性就越强。所以在构建新的表达载体时要考虑到这一因素的影响[7]。

3.宿主菌的选择：也将影响外源基因高效表达。

1.1.3 存在的问题和发展方向

总而言之，大肠杆菌表达系统是基因工程里最常用的表达系统，其优点是被广泛认可的，但与其他表达体系相比,还存在一些缺陷：在大肠杆菌中高效表达的外源蛋白往往会形成不可溶、无活性的包涵体；蛋白分泌系统不够完善，与其他原核生物相比分泌外源蛋白的能力相对要差很多；蛋白质翻译修饰加工体系不完善，所以外源蛋白不能进行翻译后的加工修饰[8]。这些缺陷的存在，使大肠杆菌表达系统的应用范围受到了很大限制。

近几年来，各项研究使得我们对大肠杆菌表达系统有更深入的了解，并且也意识到如今的重点不再是构建各种新的表达载体，而是完善现有的表达系统，只有这样才能使该表达系统中存在的缺陷得到弥补。如今，国内外的许多研究者把目光放在了重组蛋白质的正确形成、分泌和修饰加工，菌体表面表达技术及应用等内容上，致力于将大肠杆菌表达系统建立地更完善。