苦苣菜黄网病毒P基因的克隆及原核表达(2)

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2.3.1.4 PCR扩增 7

2.3.1.5 感受态大肠杆菌的制备 7

2.3.1.6 连接与转化 8

2.3.1.7 重组质粒的提取与鉴定 8

2.3.2 P基因原核表达载体的构建 9

2.3.2.1 克隆载体及表达载体的双酶切 9

2.3.2.2 重组质粒转化和提取 9

2.3.2.3 PCR及酶切鉴定 9

2.3.2.4 E.coli BL21（DE3）感受态细胞的制备 10

2.3.2.5 转化连接 10

2.3.3 目的基因表达与检测 10

2.3.3.1 诱导表达 10

2.3.3.2 表达产物的纯化 10

2.3.3.3 SDS-PAGE检测目的基因的表达 11

2.3.3.4 Western Blotting印迹分析技术 11

2.4 结果与分析 11

2.4.1 提取总RNA 11

2.4.2 P基因的扩增 11

2.4.3 SYNV P基因的序列测定与分析 12

2.4.4 原核表达载体pET30a- P的构建 14

2.4.5 重组质粒的鉴定 15

2.4.6 P基因的原核表达、蛋白纯化及鉴定 16

2.5 讨论 17

参考文献 18

致谢 19

第一章文献综述

原核表达系统是目前掌握最为成熟的表达系统,其特点主要包括细菌生长繁殖快、实验操作简单、成本低、外源基因表达产物的水平高等特点。原核表达系统中最为常见的三大表达系统分别为：大肠杆菌表达系统（E. coli expression system）、枯草芽孢杆菌表达系统（Bacillus subtilis expression system）、链霉菌表达系统（Streptomyces expression system）。然而，虽然原核表达系统具有很多的优点，也存在着许多难以克服的缺点，好在各种表达系统间可互补共存。因此，了解各种表达系统的优缺点对选择合适的表达载体具有重大的意义。

1.1 大肠杆菌表达系统

1.1.1 大肠杆菌表达系统研究现状

大肠杆菌表达系统一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统，大肠杆菌作为原核生物，其传代时间短，营养要求简单，遗传背景清晰，能够高效、迅速地表达外源蛋白，较其他基因表达系统有很大的优势。如今，有关蛋白结构以及功能研究的开展,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择[1]。通过利用大肠杆菌的表达特点，许多有价值的多肽和蛋白质获得了超量表达,如花生条纹病毒外壳蛋白基因、木聚糖酶基因等[2]。此外，Yamabhai 等[3]在大肠杆菌中成功表达了α-淀粉酶、甘露聚糖酶和壳多糖酶三种芽孢杆菌的胞外酶。

目前，在原核微生物中，大肠杆菌的分子生物学研究发展较其他几种表达系统都早，表达系统更加完善。典型表达系统主要有 Lac 启动子、Tac 启动子、PL 启动子、PR 启动子和 T7 启动子表达系统等。

pET系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。它最初由Studier[4]等利用与启动子配套构建的T7 RNA聚合酶/启动子系统,从各种基因生产大量的目的蛋白。pET系统不仅能优化靶蛋白表达，而且在基础表达水平上能控制并阻止影响宿主细胞生长速度的毒性基因的克隆，更是宿主菌的最佳背景，所以pET系统能成为最强大的系统。