BIO ORGANS同源基因干涉载体构建及拟南芥转化(2)

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4 展望 18

参考文献 19

1 前言

拟南芥是一种模式生物，基因组小，克隆其基因比较简单，种植方便，条件易得。且拟南芥是自花传粉植物，这样较容易进行遗传分析，方法简单，不同于传统的植物转基因，不需要植物的组织培养阶段，对于实验操作的要求不高。同时，拟南芥全基因组序列已于2000年底全部完成，对其不断的深化研究，为植物遗传育种的理论和应用提供良好的材料。

百脉根的BIO ORGANS（BIO)基因以及其bio突变基因是百脉根中调控花器官形态和器官大小的基因[18]。将BIO以及其bio突变基因导入烟草，与野生型相比，转基因植株出现表型改变：植株的高度发生明显变化；叶片边缘变得不规则，出现缺刻；花器官大小、数目、形态等都表现出了一定的变化[18]。豌豆中的ELE基因与BIO基因同源，位于豆科基因组的共线性区段，也具有相似的表型[19]。

利用生物信息学手段，将百脉根的BIO ORGANS基因序列与拟南芥的全基因组序列进行序列比对，发现拟南芥中有两个编号分别为At4g32295和At3g24150的基因碱基序列与百脉根中的BIO ORGANS（BIO)基因相似程度较高，推测这两个可能是BIO基因在拟南芥中的同源基因。目前尚未有针对这两个基因功能的报道，对这些基因的研究将有助于揭示百脉根BIO基因调控花瓣形态和大小的分子的机理。

RNA干涉是一种简便高效的基因功能研究方法，其原理为内源或外源性双链RNA分子进入特定细胞，使细胞内同源RNA分子发生特异性降解，因此导致相应的基因不表达，特定基因功能缺失的现象，在基因功能的研究分析过程中被广泛运用。在此实验中我们通过RNA干涉降低上述两个基因的表达量，以观察表型的变化。

基于实验室长期来对BIO基因研究新成果的认识和已有的工作基础，以及对RNA干涉技术的学习，本研究以拟南芥中BIO ORGANS相似性较高的编号为At4g32295和At3g24150两个基因为切入点，以拟南芥为实验材料，通过基因克隆，构建相应的干涉载体，利用基因工程方法转入模式植物拟南芥，来研究BIO同源基因对植物发育尤其是在控制器官大小方面的影响。观察分析转基因拟南芥相关性状的变化，尤其是对植株器官大小、数目、形状，叶片以及植株高度几个方面进行表型分析，从而探究这些基因在调控成花过程的功能，并进一步揭开BIO基因调控花瓣形态和大小的分子的机理。

2 BIO同源基因的克隆和干涉载体构建

2.1 实验材料、试剂与设备

2.1.1 实验材料

拟南芥品种为Columbia-0生态型，于光照培养箱内培养，长日照16光照/8h黑暗，22℃，70％湿度。

载体构建时使用大肠杆菌菌株DH5α，农杆菌菌株GV3101。

2.1.2 试剂

限制性核酸内切酶、Trizol、DNaseⅠ和RNase抑制剂、克隆试剂盒、T4连接酶、大肠杆菌感受态细胞、Premix Taq、Maker、割胶回收试剂盒、逆转录试剂盒、氨苄青霉素、卡那霉素、头孢霉素、琼脂糖、上海生工生物工程有限公司订购的引物、博尚生物有限公司完成测序工作。

2.1.3 实验用仪器

电泳仪、PCR扩增仪、凝胶成像系统、高速台式冷冻离心机、离心机、恒温水浴锅、-70℃超低温冰箱、超净台、控温摇床。

2.2 实验方法

2.2.1 基因克隆

2.2.1.1 拟南芥Total RNA的提取(Trizol法)

(1) 用浓度为75%的消毒酒精擦拭实验台面、移液枪、离心管架、保温瓶等器具，准备各种用具和试剂。

(2) 取0.5g~1g左右的新鲜拟南芥组织放入灭菌后的研磨小玻璃管中，研磨至破碎`751|文\论*文-网www.751com.cn，再加入0.5g~1g组织/ml的Trizol试剂，研磨均匀，再倒入预冷的1.5ml离心管中，上下剧烈振摇3min及以上，室温静置5min及以上，以4℃，12000rpm的设置离心10min。