SsGAI基因转化桂花的研究(2)

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赤霉素的信号转导有正向作用因子和反向作用因子调节，GAI基因属于GA信号转导途径中的反向作用因子之一，它编码的蛋白属于GRAS家族的DELLA蛋白。DELLA蛋白在GA信号转导途径中发挥着重要作用，赤霉素通过泛素化降解途径促使DELLA蛋白降解，从而引起赤霉素反应基因的表达[5]。本实验通过在桂花子叶切块愈伤组织中导入SsGAI基因来抑制赤霉素作用，以期得到转基因愈伤组织，得到矮化的桂花植株。

1材料与方法

1.1.材料

大花金桂子叶切块愈伤组织（大花金桂植物成熟种子，2013年采集）

1.2农杆菌的培养、活化及侵染液的制备

将含有目的基因片段（SsGAI）的根瘤农杆菌从-80℃冰箱中取出，于LB+50mg/L Km（卡那霉素）+40mg/L Rif（利福平）平板上进行活化，平板倒置于28℃暗培养箱2-3d。从平板上挑取农杆菌单菌落，分别接种于5ml含有50mg/L Km（卡那霉素）+40mg/L Rif（利福平）的LB液体培养基中，置于摇床上于28℃、200r/min条件下振荡培养16-20h。取100μL菌液分别接种于20ml含有50mg Km（卡那霉素）+40mg/L Rif（利福平）的LB液体培养基中论文网，于28℃、200r/min条件下振荡培养。待至对数生长期时，取菌液于室温下5000r/min离心5min，弃上清，以1/2MS液体培养基重悬浮菌体2次，调节OD600=0.5，根据侵染的体积加入乙酰丁香酮（As，每10ml侵染液加入10μL）。

SsGAI农杆菌对数生长期

Vir区基因的活化作为农杆菌基因转化的开关直接调控着T-DNA的转移。遗传转化研究中常用的Vir区基因活化诱导物质是酚类化合物乙酰丁香酮（acetosyringone，As）[6]。

1.3预培养

取大小约为0.5cm3愈伤组织，用刀片划伤表面，接种于预培养培养基（1/2MS+0.5mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+0.05% PVP）中，24±1℃，暗培养2天。

许多研究结果认为农杆菌侵染转化前外植体需要预培养[7]。预培养可以使愈伤组织伤口周围的细胞得到修复`751*文+论]文|网\www.751com.cn；预培养可促进愈伤组织细胞的分裂，而处在分裂状态的细胞相较于其他细胞更容易整合外源DNA；通过预培养还可以减少外植体转化过程中的杂菌污染率[8]。不同的植物预培样时间要根据植物的分化速度来选择预培养时间。桂花的分化较快，一般预培养为1-2天[9]。