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表3.3结晶液条件17
表3.4野生型肌红蛋白结晶液条件18
1 绪论肌红蛋白在人体内具有储氧的功能，是一种氧结合血红素蛋白，它主要分布于心脏和骨骼肌组织中。临床上许多疾病如心脏病、老年痴呆症、帕金森病和肿瘤等与肌红蛋白被自由基氧化过程有着密切的关系，因此研究肌红蛋白的结构与功能有着重要的意义。1.1 肌红蛋白的结构与功能肌红蛋白（Myoglobin，Mb）和血红蛋白是人们研究较为透彻的蛋白之一，是人们用来研究蛋白质结构和功能的模型分子，而 Mb 不但具有储氧和促进氧在细胞中扩散的功能，还具有过氧化物酶活性。Mb 是第一个获得三级结构的蛋白， 它的相对分子量只有 16700，结构也较简单，是由一个血红素辅基和一条缠绕它的多肽链组成。多肽链 75%折叠成α-螺旋构象，共有 8 段主要的螺旋，每段α-螺旋长度都不同，构成单结构域多肽链，α-螺旋拐弯处的不规则卷曲是由 1 到 8 个氨基酸残基构成[1]。Mb 分子内含有一定的空腔，小分子（如 O2、CO 和 NO）可以结合与解离[2]，并且肌红蛋白结构中具有极性的氨基酸残基几乎全部分布在分子表面，可与水结合，使 Mb 具有可溶性，而非极性残基分布在分子内部，使内部呈一个疏水空穴，在这个空穴里，埋有一个血红素辅基，血红素由原卟啉环和一个铁原子组成，铁原子位于卟啉环中央，它有 6个配位键，其中 4个与卟啉环平面 N结合，两个与卟啉环平面垂直， 即其中一个(第5 个配位键)与 93位上的远端 His(F8)残基的咪唑环 N结合
肌红蛋白结构图另一个(第6 个配位键)处于“开放”状态， 用作氧气的结合部位； 两个保守氨基酸 （即64 位His 以及 68 位的 Val）就在它附近（见图1-1b），中间的空腔可容纳一个氧气分子，64位His 可用氧形成氢键达到稳定氧气绑定的作用。 血红素中的铁原子如果处在水环境中就很容易被氧化成三价铁，并因此失去氧合能力。蛋白质正为血红素提供一个疏水空腔，避免 2价铁发生氧化，以保证血红素的氧合能力[3]。1.2 肌红蛋白的分离纯化方法本实验中的肌红蛋白 H93M 突变体蛋白是用大肠杆菌转化表达，对菌体细胞进行超声破碎后所得，因此蛋白中有很多杂蛋白和非蛋白物质。所以我们采用以下几种方法对蛋白进行分离纯化：（1）硫酸铵分级硫沉向蛋白质溶液中加入某些浓的无机盐，可以使得蛋白质溶解度降低，从而从盐溶液中析出，并且不同的蛋白在不同的盐浓度中溶解度不同。本实验中肌红蛋白突变体 H93M 蛋白用硫酸铵常作为蛋白质分离的盐溶液，实验表明，硫酸铵饱和度为 60%-100%可导致肌红蛋白沉淀析出，随着饱和度的提高，回收率逐渐提高[4]。该课题先采用浓度为65%的硫酸铵饱和溶液除去一些杂蛋白和非蛋白物质，再采用 95%的硫酸铵饱和液沉淀析出肌红蛋白突变体H93M。
（2）阴离子交换层析离子交换技术是目前分离蛋白应用较为普遍成熟的技术。 离子交换柱中的基质带有电荷，通过与蛋白质带电的基质间的可逆吸附的差异达到分离目的。由于蛋白质具有等电点，在不同的 pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。本课题的肌红蛋白的等电点为 7.07，选用pH 8.5的缓冲液，使肌红蛋白带负电荷，改变洗脱液盐浓度将其与其他杂蛋白分离。（3）凝胶层析凝胶层析又称为凝胶排阻层析、分子筛层析等。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。分子量较大的蛋白不会进入凝胶颗粒从而随缓冲液流出，而分子量较小的蛋白进入到凝胶颗粒流出的路径较长，故柱保留时间长。这样样品蛋白经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。葡聚糖凝胶 G-75分离范围 3000-80000 适用于蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定。肌红蛋白的分子量大约为 16700，适用于sephadex G-75分离。1.3 肌红蛋白与硫化物的反应人类的血红蛋白和肌红蛋白在血红素远端位点有组氨酸， 并且在有H2S和氧气存在时形成硫血红素或者过氧化氢。贝茜提到 Hoppe-Seyler 等人在 1866年发现 Mb-O2和 H2S反应生成一种肌红蛋白衍生物称之为硫化肌红蛋白， 这些衍生物有一个硫原子结合在血红素吡咯环B，使得肌红蛋白对氧的亲和力更低[5]。同时也有报道称，在铁卟啉中心并入一个硫原子会使得肌红蛋白对氧的亲和力降低，称为硫肌红蛋白（SMb）。