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摘 要：本文以市场上买的安琪酵母粉为材料， 从中筛选出酵母菌并用 YPD培养基扩大培养。在扩大培养过程中，制作酵母的生长曲线。选取对数期的酵母细胞进行超声波破碎，离心收集上清液。然后采用硫酸铵盐析法对上清液中的蛋白进行初步分离，缓冲液透析除盐。将初步分离得到的蛋白液用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测， 根据酵母Trr2p蛋白的相对分子质量， 从而确定酵母Trr2p蛋白的存在。37737
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毕业论文关键词：酵母培养；酵母 Trr2p 蛋白；硫酸铵盐析法；聚丙烯酰胺凝胶电泳
Yeast Protein Trr2p Preliminary Isolation
Abstract: The materials of angel yeast powder were bought from the local market,The screened yeast strains were further cultured in YPD medium. In the process ofexpanding training, yeast growth curve were produced. At the logarithmic phase ofyeast growth, the yeast cells were collected and broken using centrifugation andultrasonic techniques, respectively. The proteins in the supernatant were salted outwith ammonium sulfate. The total proteins were dialyzed. The primary separationprotein were detected by polyacrylamide gel electrophoresis assay, according to therelative molecular mass of the yeast trr2p protein, to determine the presence of yeastTrr2p proteins.
Key words: Yeast culture; Yeast trr2p protein; Ammonium sulfate salting out method;Polyacrylamide gel electrophoresis
目 录
摘 要1
引言.. 1
1. 材料与方法 2
1.1 实验所用的材料 2
1.1.1 实验菌株来源2
1.1.2 实验所用的培养基及试剂 2
1.1.3 主要的仪器与设备.. 3
1.2 实验方法.. 4
1.2.1 酵母活化4
1.2.2 酵母初筛4
1.2.3 酵母复筛5
1.2.4 酵母菌鉴定. 5
1.2.5 酵母的扩大培养及生长曲线绘制..5
1.2.6 酵母全蛋白的提取.. 5
1.2.7 盐析法初步提取酵母Trr2p 蛋白.6
1.2.8 SDS-PAGE电泳测定酵母 Trr2p 蛋白6
2. 结果与分析 7
2.1 酵母活化的结果 7
2.2 酵母初筛的结果 7
2.3 酵母复筛的结果 8
2.4 酵母鉴定的结果 8
2.5 酵母生长曲线的绘制 9
2.6 酵母破壁条件的确定.10
2.7 SDS-PAGE电泳检测酵母 Trr2p 蛋白的结果. 10
3. 结论.. 11
参考文献. 11
致谢13
引言Trr2p 蛋白(Thioredoxin Reductase 2 Protein)即硫氧还蛋白还原酶属于硫氧还蛋白。而硫氧还蛋白是一类高度保守的低分子量蛋白质，它广泛分布于植物、细菌、酵母和动物中，根据氨基酸序列的不同，硫氧还蛋白分为家族I和家族 II。硫氧还蛋白具有多种生物学功能，对文持体内稳定的氧化还原状态具有重要作用，具有调节细胞生长、抑制凋亡、调节基因转录等功能[1-2]。不同的硫氧还蛋白分布在不同的生物体内或不同的部位。酵母Trr2p 蛋白，它位于生物线粒体中。目前研究显示,它与机体生长发育、氧化应激损伤、肿瘤、器官缺血再灌注损伤等多种疾病相关。 线粒体型硫氧还蛋白参与机体调节的具体机制,一方面是通过其分子内巯基/二硫键的相互转换来实现,另一方面是作为信号分子参与多种信号途径[3]。对酵母Trr2p 蛋白的初级分离的研究，对进一步纯化酵母 Trr2p 蛋白、研究它与某些疾病的关联及具体参加的生化反应具体功能有十分重要的意义。
1. 材料与方法1.1 实验所用的材料1.1.1 实验菌株来源市场上买的安琪酵母。1.1.2 实验所用的培养基及试剂液体YPD培养基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。固体YPD培养基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂粉。A 液:0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取 53.7 g 磷酸氢二钠加去离子水精确配制 1000 mL。B 液:0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取 31.2 g 磷酸二氢钠加去离子水精确配制 1000 mL。0.2 mol/L ，PH 5.8 磷酸盐（PBS)缓冲液：取A液 40.0 mL，取 B液 460.0mL,然后将这两种溶液边混合边用PH计检测，调配成 500 mL的缓冲液。染液 （考马斯亮蓝 G250,0.01%)： 称取0.1 g 考马斯亮蓝 G250 溶于 50 mL 乙醇(95%)中，再加 100 mL 浓磷酸，然后加蒸馏水定容到1000 mL。0.2 mol/L ，PH 6.9 磷酸盐（PBS)缓冲液：取 A液 275.0 mL，取 B液 225.0mL,然后将这两种溶液边混合边用PH计检测，调配成 500 mL的缓冲液。90%的饱和硫酸铵 （25℃） ； 称取 662 g 固体硫酸铵加蒸馏水定容到1000 mL。0.2 mol/L ， PH 7.5 磷酸盐 （PBS)缓冲液： 取 A液420.0 mL， 取 B 液 80.0 mL,然后将这两种溶液边混合边用PH计检测，调配成 500 mL 的缓冲液。0.05 mol/L ，PH 8.0 三羟甲基氨基甲烷-缓冲液（Tris-Hcl)：称取 6.1 g Tris碱溶于 800 mL 去离子水中，搅拌溶解，加入 2.1 mL 浓盐酸调节 PH 值到 8.0，