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摘要：根瘤菌与豆科植物可以通过一系列复杂作用形成共生固氮体系。这种共生体系能够将大气中的N2还原为植物可利用的氮元素，同时促进土壤中的氮循环。研究中发现可结瘤的菌株中带有固氮基因及结瘤基因的共生岛可以通过水平转移的方式转入不能结瘤的菌株中，使之可以与植物形成固氮体系。本实验利用转座子插入失活的方式建立了Rhizobium etli CFN42突变子文库，将其作为受体菌，选用实验室中已经在共生岛间隔区插入kanamycin抗性基因的A. caulinodans ORS571（将其命名为Azc1）作为供体菌，通过二亲接合的方式筛选得到可以接受共生岛的Rhizobium etli CFN42突变株。经初步验证后，利用Arbitrary Primer PCR鉴定出了转座子插入到了基因RHE-RS01180的位置。最后构建了Rhizobium etli CFN42 △RHE-RS01180，与Azc1进行二亲接合以及测定了接合频率。29009
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毕业论文关键词：菜豆根瘤菌CFN42；共生岛；基因水平转移
Selection of the Gene that Influences the Horizontal Transfer of the Symbiosis Island in Rhizobium etli CFN42
Abstract： Rhizobium and legume can form symbiotic nitrogen fixation system, reducing N2 in the atmosphere into nitrogen for the plant and promote the cycling of N. Research showed that symbiosis island which contain the gene fix and nod can be transferred into the bacteria which cannot form nodules.
This Study established a Rhizobium etli CFN42 mutation library using transposon insertion mutation and use it as the receptor strain, choose the lab strain A. caulinodans ORS571 kanamycin-knock in strain as the donor strain and name it Azc1, conjugate the two strains and selected the strains that can accept the symbiosis island. Then used Arbitrary Primer PCR and determined the transposon inserted into the gene RHE-RS01180. At last, Rhizobium etli CFN42 △RHE-RS01180 was established, conjugate with Azc1 and test the transfer frequency.
Key words: Rhizobium etli CFN42；Symbiosis Island；Horizontal Gene Transfer
目 录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法5
1.1 菌株和质粒5
1.2 培养基和培养条件5
1.3 实验室所用抗生素6
1.4 酶和试剂6
1.5 实验室基本试验方法6
1.6 筛选流程8
1.7 构建Rhizobium etli CFN42 突变子文库8
1.8 Rhizobium etli CFN42突变株与Azc1二亲接合9
1.9 Arbitrary Primer PCR9
1.10 利用overlapping PCR方法RHE-RS01180基因两端的序列进行互补连接10
1.11重组质粒1180-pEX18Gm的构建12
1.12电转化将酶连产物转入感受态细胞中13
1.13 Rhizobium etli CFN42 RHE-RS01180缺失株的构建14
1.14二亲结合测定共生岛水平转移频率14
2 结果与分析14
2.1 接合子初步验证14
2.2 转座子插入位点分析15
2.3 Rhizobium etli CFN42 RHE-RS01180缺失株的构建16
2.4 接合频率测定18
3 讨论19
致谢20
参考文献21
附录 文中所用的略缩语22
菜豆根瘤菌CFN42中影响其接受共生岛的基因筛选
引言 根瘤菌是生活在土壤中的，能与豆科植物等通过共生作用形成根瘤或茎瘤的革兰氏阴性细菌[1]。根瘤菌和豆科植物能够通过一系列复杂的反应来形成共生固氮体系，将大气中的N2还原为植物可以利用的氮元素，同时豆科植物可以为根瘤菌提供碳源、能源以及其他营养物质。除了给植物提供营养，多余的氮可流入土壤使氮元素增加。根瘤菌与植物共生形成的固氮体系所固定的氮大约占全球固氮总量的65%，是非常重要的固氮形式。
Azorhizobium 是一种生活在土壤中的革兰氏阴性菌，其在无氮培养基（含文生素）中的生长状态良好。葡萄糖以及有机酸类可以被利用做碳源，NH4或N2可以被用作氮源，不能进行反硝化作用。Azorhizobium caulinodans是属于固氮根瘤菌属中的一种模式菌，其代表菌株是A. caulinodans ORS571。生物固氮作用是原核生物的一种生化过程，其在全球氮循环中有着非常重要的作用。A. caulinodans ORS571具有双重能力，它可以作为独立生活的生物来进行固氮作用，也可以与毛萼田菁发生共生作用，毛萼田菁是一种快速生长、耐沿的热带豆科植物[2]。A. caulinodans ORS571与毛萼田菁形成的共生固氮体系固氮效率极高，可以形成根瘤和茎瘤[3]。2008年A. caulinodans ORS571全基因组序列测序完成，发现到一个大小约为87.6 kb的共生岛，该共生岛含有许多与转移有关的基因，并且包含与结瘤因子合成相关的基因[4]。Rhizobium etli也是一种革兰氏阴性细菌，是菜豆（Phaseolus vulgaris）的共生体，并且该菌株被广泛运用于研究细菌的代谢以及基因组的动态变化[5,6]。Rhizobium etli CFN42可以通过诱导作用在菜豆上形成根瘤。它的基因组包括一个染色体和751个大小从184kb到600kb不等的质粒[7]。其中一个质粒，p42d，包含大部分与结瘤以及固氮相关的基因，被称为共生质粒（pSym）[8]。