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    摘要：大豆花叶病毒 SMV 的强毒株系 SC7 严重危害大豆。本研究利用 165 份大豆突变体材料，使用 355K SoySNP 芯片对该群体材料进行基因分型的结果作为基因型数据，统计 165份突变体材料对SC7 的发病率作为表型数据，表型数据与基因型数据相结合发掘 SC7 抗性新基因。通过全基因组关联分析得到了 4 个与 SC7 显著关联的 SNP 位点，分别位于 1 和 3 号染色体上，另外 2 个位于 13 号染色体上，通过基因组功能注释，发现了 1 号染色体上 2 个可能与抗病相关的基因。这些研究结果将为发掘大豆抗 SMV 新基因提供依据。27443
    毕业论文键词：大豆花叶病毒（SMV） ；全基因组关联分析；SNP 标记；基因定位
    Discovering new resistance genes to SMV by using mutant library insoybeanAbstract: Soybean mosaic virus (SMV; genus Potyvirus, family Potyviridae) is the most prevalent anddestructive viral pathogen to soybean. In this study, using 165 soybean mutants, we genotyped thispopulation by 355K SoySNP array, counted disease rates of 165 soybean mutants to SMV, and connectedthe disease rates with the genotype data to discover new resistance genes to SC7 through genome wideassociation analysis. The result showed there were 4 significant SNPs associated with SC7, of which twoSNPs were located on chromosome 1 and chromosome 3 respectively, and the other two SNPs were locatedon chromosome 13. Moreover, we discovered two resistance genes on chromosome 1, which may associatewith resistance to SMV. The results can provide basis to select new SMV-resistant genes in soybean.Key words: SMV; Genome-wide association analysis; SNP marker; Gene mapping
    目 录
    摘要1
    关键词1
    Abstract1
    Key words1
    1 引言1
    1.1 研究的意义1
    1.2 国内外研究动态 2
    1.3 病原物 SMV 研究 2
    1.3.1 SMV 基因组学研究2
    1.3.2 SMV 株系划分2
    1.4 大豆抗大豆花叶病毒（SMV）育种 2
    1.4.1 抗源筛选2
    1.4.2 大豆对 SMV 抗侵染遗传研究3
    1.4.3 大豆对 SMV 抗扩展遗传研究3
    1.4.4 种粒斑驳抗性遗传研究3
    1.5 SNP 关联分析在大豆育种中的应用3
    1.6 本研究的意义和目的4
    1.7 技术路线4
    2 材料与方法4
    2.1 试验材料4
    2.2 试验方法4
    2.2.1 试验设计4
    2.2.2 抗性鉴定与统计4
    2.3 数据分析5
    3 结果分析5
    3.1 发病率描述性分析5
    3.2 SNP 关联分析6
    3.3 候选基因的分析7
    4 讨论8
    致谢 8
    参考文献 8
    1 引言1.1 研究的意义大豆花叶病毒 ( Soybean Mosaic Virus，SMV) 病是一种分布广泛、危害严重的世界性大豆病害，也是目前我国东北、黄淮海、长江流域和南方大豆产区最重要的大豆病害之一。植株受侵染后出现花叶，叶片内叶绿素含量降低，影响光合作用，致使产量下降；籽粒出现褐斑，蛋白质含量与含油量降低，严重影响大豆的外观品质和商品价值。大豆花叶病毒病流行是 SMV株系、带毒病株、环境以及传播介体等因素相互作用的结果。通过调整播期，错开蚜虫迁飞高峰期与大豆易感病期，选用无毒种子等措施，可以防治大豆花叶病毒病。但选育抗性优良的大豆品种才是根本解决方法，因此必须进行抗大豆花叶病毒新基因的挖掘。1.2 国内外研究动态SMV 属马铃薯 Y 病毒科(Potyviridae)Y 病毒属(Potyvirus)，大豆花叶病毒种。病毒粒体由蛋白质及 RNA组成，其中蛋白质占 94.7%，RNA占 5.3%。提纯病毒对紫外光有吸收峰，最高值为 258～263nm，最低值为 240～244nm。SMV稀释限点为 10-2～10-4，致死温度 55～65℃(10min)，常温下体外存活期3～4d，0℃下可达 120d，温度越低，相对而言存活期越长。SMV 可通过带毒病株、带毒种子以及介体传播。带毒种子的种传率是春大豆 SMV病害流行的主导因素，而夏大豆的主导因素为品种抗病性；大豆苗期易感病，此时若遇蚜虫的迁飞高峰期，则容易造成大规模的病害流行。1.3 病原物 SMV 研究1.3.1 SMV 基因组学研究SMV 基因组为单链正义RNA， 全基因组序列分析发现SMV全长约9600个核苷酸，5'端有一共价键连接的金属蛋白 Vpg (Virus genome-linked protein，Vpg)，3'端有一个Poly(A)尾巴。整个基因组按一个阅读框架进行翻译，产生一个多聚蛋白前体，通过蛋白酶切割加工后形成 11个不同功能的成熟蛋白。从 5'末端到 3'末端依次为 VPg(21K,VirialProtein Genomic-linked)、5 '-NTR(non-translation region)、第一蛋白(First protein，P1)、辅助组分-蛋白酶(Helper component-proteinase，HC-Pro)、第三蛋白(Third protein，P3)、PIPO(Pretty Interesting Potyviridae ORF)、第一个 6K 蛋白(6K1)、圆柱形内含体蛋白(Cylindrical protein，CI)、第二个 6K 蛋白(6K2)、核内含体蛋白 a (Nuclear inclusion body‘a’ protein， NIa )、 核内含体蛋白 b (Nuclear inclusion body ‘b’ protein， NIb)、 外壳蛋白(Coatprotein，CP)[1-4](图1)。1.3.2 SMV 株系划分SMV 与寄主共同进化过程中，产生了多种致病性分化，导致致病类型有所不同，称为株系。由于选择的鉴别寄主不同，分离物不同，国内外对SMV株系划分并不一致。在美国，利用Clark 和 Rampage这两个感病品种以及Buffalo、Davis、Kwanggyo、Marshall、Ogden和 York 等751个抗病品种作为鉴别寄主，将其 98 份本土 SMV分离物划分为 G1-G7 七个株系[5]。在此基础上，又划分出了 G3A、G5H、G7A、C14、G5HD 和G7H等新株系[6,7]。 日本高桥[8]以四个鉴别寄主将本土102份SMV株系划分为A-E株系。国内以诱变 30、 Davis、 Kwanggyo、 科丰 1 号、 齐黄 1 号、 南农 1138-2、 铁丰 25、 Buffalo、8101 和早熟 18 作为一套通用鉴别体系，将全国 SMV重新划分为SC1-SC21[9-11]。1.4 大豆抗大豆花叶病毒（SMV）育种1.4.1 抗源筛选我国是大豆的原产地，存在着广泛的不同程度的抗 SMV 材料，国内早在上世纪对抗源的筛选做了大量的工作， 并筛选和选育出了一批抗性良好高产的品种， 如科丰 1 号、铁丰 18、汾豆 56、汾豆 60；黄淮地区的科黄 8 号、诱变 30、齐黄 1 号、齐黄 10、齐黄20、鲁豆 1 号；长江流域的 JR44-1、NJR25-8、NJR23-8、徐豆 1 号等[12]。与此同时，国内学者对新育成的品种会进行抗性筛选，获得了许多抗性较好的材料。地方品种与野生大豆中同样有较多的抗性资源。陈珊宇等[13]在南方大豆种质资源中筛选出对 SC3、SC11、SC13高抗的栽培大豆品种：樟潭大青豆，野生大豆品种：ZYD03715、ZYD04257和上饶青皮豆。野生大豆是发掘更多抗性基因的新的研究方向。1.4.2 大豆对 SMV 抗侵染遗传研究最早 Koshimizu 等[14]研究发现大豆对 SMV的抗性由核基因控制，且抗、感杂交 F1代表现为抗病，F2 代群体3 抗：1 感分离，初步表明大豆对 SMV的抗性由一对显性基因控制。随后通过分子标记技术和精细定位，抗性基因被精确定位于大豆染色体的多个连锁群中。美国发现并命名了 3 个抗性基因：Rsv1、Rsv3、Rsv4，分别位于 F、B2、D1b 连锁群上[15]。战勇等[16]人以科丰 1 号×南农 1138-2 为亲本构建 RIL 群体对 SC7 株系进行鉴定， 结果表明其抗性基因Rsc7 在N8-D1b+W 连锁群上； 并将其与之连锁的Rsa、 Rn1、Rn3、Lc5t 的抗性基因进行顺序排列：Rsa-30.6cM - Rsc7 - 22.1cM - Rn3 - 10.3cM - Rn1 -15.8cM - Lc5t。李春燕[17]发现科丰1 号所携带的 Rsc10 抗性基因位于D1b 连锁群上。陈珊宇[18]利用分子标记技术（SSR）发现野生大豆 ZYD03715 对 SC13 的抗性由一对隐性遗传基因 Rsc-13-1 控制，经BSA（Bulked Segregation Analysis）分析法，Rsc-13-1 位于D1b 连锁群上。越来越多的抗性基因被定位在大豆的连锁群上，且从每条连锁群上看，抗性基因成簇分布（如表 1） 。表 1. 抗 SMV基因在染色体上的分布连锁群 抗性基因F Rsv1、Rsmv3、Rsc11、Rsc14、Rsc14QB2 RSV3、RSC4D1b Rsv4、Rsc10、Rsc13N8-D1b+W Ra、Rn1、Rn3、Rsc7、Rsc8、Rsc91.4.3 大豆对 SMV 抗扩展遗传研究智海剑等研究发现大豆对 SMV除了具有抗侵染性，还具有抗扩展性，进一步研究表明抗扩展性的遗传符合 D2 模型，即其抗扩展性是由一对加性主基因+加性-显性多基因控制的[19]。郭丹丹等[20]以中豆 29、中豆 32 构建 RIL 群体，鉴定出大豆对 SC3株系的抗扩展遗传符合 B-2-3 遗传模型，即两对加性主基因控制。1.4.4 种粒斑驳抗性遗传研究大豆种粒斑驳严重影响外观品质。胡国华[21]认为种粒斑驳抗性由显性基因控制，其中抗性基因数目同亲本对种粒斑驳抗性强度有关。 栾晓燕[22]认为种粒斑驳抗性由两对互补显性基因控制。滕卫丽[23]用 SSR 标记技术和 BSA 分析法发现南农 8143 对 SC1 株系抗种粒斑驳由一对显性基因控制，其基因位于F 连锁群上。1.5 SNP 关联分析在育种中的应用SNP标记即单核苷酸多态性，是基因组上单个核苷酸差异导致的序列多态性，具有分布广泛，多态性丰富；遗传稳定性强；易于实现自动化与高通量等优点，在小麦、水稻、大豆、玉米等作物中有广泛的应用前景。关联作图(Association mapping)又称为连锁不平衡(Linkage mapping)作图，是利用连锁不平衡(LD)，通过统计方法将群体中性状表型与基因型多样性相结合，可以鉴定出与表型相关的功能基因，或与之连锁不平衡的基因位点[24]。 植物数量性状的遗传通常较复杂， 传统连锁作图检测效率低， 应用关联作图，可以提高分辨率，减少群体构建所需时间，呈现更高的多态性。1.6 本研究的意义和目的SC7株系是黄淮海、南方大豆产区花叶病毒病的流行强毒株系。本课题以现有的大豆突变体库为研究材料， 结合 SNP 标记与表型性状进行全基因组关联分析，挖掘抗 SC7的新基因，进一步为大豆抗花叶病毒育种、遗传研究提供重要的理论依据。2.1 试验材料本研究所使用的试验材料有 SC7 株系、 感病材料南农 1138-2； 南农 86-4、 南农 94-16；韩锁义博士所提供的大豆突变体库三部分组成。 其中 SC7株系为黄淮海及南方大豆产区流行强毒株系。 南农86-4经过选择南农1138-2的优异变异单株系统选育而成。 南农94-16由751丰×南农菜豆 5 号杂交，再经系谱选育而成。突变体库（NJAU-M） ：165 份突变体材料由 93 个南农 86-4 突变后代个体和72 个南农 94-16 突变后代个体组成。其中，南农86-4 经 60coy 射线辐射，吸收剂量为350Gy，共 9000 粒。化学诱变用纯水浸泡4 小时左右，再用 0.4%的甲基磺酸乙酯（EMS）浸种8 小时，共 2500 粒，用流水冲洗1 小时，风干后立即播种[25]。2002 年，南农 94-16 种子8000 粒经 NaN3 浸种 5 小时后用流水冲洗 1 小时，风干后马上播种。2003 年取诱变一代 M1 种子 3000 粒用 60coy 射线辐射，吸收剂量为 350Gy。2005 年 0.4%的甲基磺酸乙酯（EMS）处理种子 2500粒。2.2 试验方法2.2.1 试验设计2016 年 9 月， 在南京农业大学江浦农场大豆试验站的防虫温室中， 将 SMV株系 SC7在感病材料南农 1138-2 上繁殖保存。将突变体库的 165 份大豆材料分别播种于带有沙土的花盆中，每盆播种 35 粒左右饱满籽粒。出苗后除去病苗和弱势苗，每盆大致保留30 株幼苗。当大豆幼苗完全展开第一对真叶后进行接种。将感病材料 1138-2 的发病叶与磷酸缓冲液加入消毒过的研钵中研磨至匀浆，再用毛刷将汁液轻轻地均匀涂抹在第一对真叶上，再用清水轻轻冲洗。接种一周后每隔三天进行一次抗性调查记载，直到症状稳定，大约需要 20 天。
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