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摘要拟除虫菊酯类农药残留已成为主要农药残留类型之一，菊酯的大量使用而导致的农药残留问题日趋严重，对生态环境的破坏和人体健康的影响已经引起人们的广泛关注。论文筛选了降解拟除虫菊酯菌株并建立了大豆乙酰酯酶检测体系测定菌株对农药的降解情况。大豆磨成干粉，经石油醚抽提油脂、30％硫酸铵沉淀、利用双水相萃取大豆乙酰酯酶，选用24.8％PEG400（g/g）、18.7％（NH4)2SO4（g/g）的体系进行双水相萃取，4℃、10000g 离心 10min，并利用 4-甲基伞形酮乙酯和乙酰对硝基苯酚评测双水相体系。用DEAE-纤文素离子交换柱的处理初步分离大豆酯酶，再利用制备电泳纯化大豆酯酶， 20mL 12％分离胶，4mL 5％浓缩胶、20mA稳流电泳。分离出的大豆酯酶经活性电泳考马斯亮蓝染色检验纯度。 27247
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毕业论文关键词 双水相萃取 大豆乙酰酯酶 电泳分离 拟除虫菊酯
Title Isolation and degredation of a Pyrethroid -degreding strain Abstract Pyrethroid pesticide residues has become one of the main types of pesticides。extensive use of pyrethroid pesticide residues which led to increasingly serious impact on the ecological damage to the environment and human health has attracted widespread attention. We use soybean acetylesterase detection system to screen the pesticide degradation strains. Ground soybeans into powder, oil extraction by petroleum ether and 30% ammonium sulfate precipitation, use aqueous two-phase extraction soybean acetylesterase,at 24.8% PEG400 (g / g), 18.7% (NH4)2SO4 (g / g) of dual-phase extraction system, 4 ℃, 10000g centrifugal 10min, and the use of methyl ethyl ketone and acetyl umbrella nitrophenol reviews ATPS. The preliminary separation of soybean esterase treating with DEAE-cellulose ion exchange column, and then purified by electrophoresis, with 20mL 12% separating gel, 4mL 5% stacking gel, 20mA steady electric current. The purity of isolated soybean esterase test by Coomassie blue staining after electrophoresis. Keywords Aqueous two-phase extraction Soybean acetylesterase Electrophoretic separation，Pyrethroid
目次
1绪论1
1.1拟除虫菊酯类农药1
1.2大豆乙酰酯酶2
1.3农药残留检测的研究进展3
1.4拟除虫菊酯微生物降解的研究进展3
1.5本实验研究的方法和内容5
2实验部分8
2.1实验材料与设备8
2.2实验方法9
3实验结果与讨论18
3.1大豆乙酰酯酶的提取与纯化结果18
3.2抗拟除虫菊酯的菌株的筛选28
结论31
致谢32
参考文献33
1 绪论 1.1拟除虫菊酯类农药 1.1.1 拟除虫菊酯类农药的简介 农药的分类方式有多种，按化学成分可分为：有机氯化合物、有机磷化合物、氨基甲酸酯、有机氮化合物、有机氟化合物、有机锡化合物、拟除虫菊酯、特异性杀虫剂等。 最初拟除虫菊酯是由一种杀虫植物除虫菊中所含的有效成分除虫菊酯发展而来的。从除虫菊花中提取除虫菊酯，不但成本高，而且也满足不了大量生产需要。通过化学合成手段人工合成除虫菊酯，同时进一步通过改变和简化除虫菊酯的结构，寻找到对哺乳动物安全性高、对害虫毒杀作用更强、具有广谱杀虫活性、更容易合成的杀虫剂，一直是人们研究与开发除虫菊酯类杀虫剂的主要目标。 发展为根据天然除虫菊素的结构人工合成的一类仿生杀虫剂后，它逐渐取代了有机磷农药和有机氯农药，并广泛应用于农作物害虫和室内卫生害虫的防治。拟除虫菊酯主要被应用在农业上，如防治棉花、蔬菜等植物的害虫，这方面的用量占总销售量的 95%。除此之外，拟除虫菊酯还作为家庭用杀虫剂被广泛应用，防治蚊蝇、蟑螂及牲畜寄生虫等。 拟除虫菊酯类农药残留已成为目前农产品中的主要农药残留类型之一，在过去此类农药一直被认为在体内易被氧化酶系统降解，无蓄积性，是毒性较低，使用安全的农药。后续研究表明，此类农药有蓄积性，长期接触会引起慢性疾病；有些品种有致癌、致畸、致突变作用；对哺乳动物具有中等的神经毒性、免疫系统毒性、心血管毒性和遗传毒性；对家蚕、蜜蜂和鱼类等水生生物高毒，对鱼类的 LC50常在每升几微克的水平，目前尚无特殊的治疗药物。拟除虫菊酯类农药残留已成为主要农药残留类型之一，菊酯的大量使用而导致的农药残留问题日趋严重，对生态环境的破坏和人体健康的影响已经引起人们的广泛关注。 而微生物在降解农药残留中具有重要的作用，并因其经济安全，方便高效的优点成为消除菊酯农药污染的重要手段。 1.1.2 拟除虫菊酯类农药的致毒机理： 人们从除虫菊花的正己烷抽提物中相继分离鉴定出一些化学成分，发现其中 6个化合物具有显著的杀虫活性，即除虫菊酯Ⅰ、Ⅱ，瓜菊酯Ⅰ、Ⅱ，茉莉菊酯Ⅰ、Ⅱ。这类化合物均为淡黄色粘稠状液体，对光、热、空气及碱不稳定。对蚊、蝇等具有很好的毒杀作用。根据丁智慧 等人，除虫菊酯的结构可以发现这751个化合物是由两种结构类似的酸和三种结构类似的醇形成的酯类化合物。菊酸部分一直被认为是除虫菊酯类化合物的杀虫活性中心。拟除虫菊酯常依其化学结构分为两种类型[2]，不含有 α-氰基的 I 型和含有 α-氰基的 II 型，I 型拟除虫菊酯主要有：烯丙菊酯、胺菊酯、苄呋菊酯、氯菊酯、苯醚菊酯等。II 型拟除虫菊酯主要有：氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯等。II 型广泛用于农林害虫和卫生害虫的防治，由于其广谱性和高效性，但其毒性较强。 1.1.3 拟除虫菊酯类农药的研究进展 除虫菊为菊科小黄菊属植物。原产中欧国家，大约在公元 14 至 15 世纪的时候，人们发现了除虫菊的杀虫活性，并将其白色干燥花做成粉状物当杀虫剂使用。20世纪上半叶，人们从除虫菊花的正己烷抽提物中相继分离鉴定出一些化学成分。1949 年，美国的 Schechter 和La Forge 合成了第一个有强杀虫作用的拟除虫菊酯丙烯除虫菊酯，且其合成较天然除虫菊酯容易，安定性及挥发性都比天然除虫菊酯好。受丙烯除虫菊酯开发成功的鼓舞，各国的学者又进一步合成了一系列的拟除虫菊酯。其中，由英国 Elliott M 等合成的苄呋菊酯致死作用是天然除虫菊酯的 20倍。拟除虫菊酯作为家庭用杀虫剂得到成功后，人们逐步把目光转向农业。作为农业用杀虫剂，拟除虫菊酯必须满足生产成本低、在野外有足够长的有效期的要求。日本的鸭下及松尾等对拟除虫菊酯结构中醇的部分作了较大的改变，合成的拟除虫菊酯如苯醚菊酯和苯腈菊酯，在田间使用显示出较强的杀虫活性和较长的有效期。同时，英国 Elliott M等也在从事光稳定性拟除虫菊酯的研究。他们对 Farkas 等合成的 DV 酸进行了再评价，使用不同的方法，合成了一系列 DV 酸，通过和几种醇化合物缩合后制备了一系列拟除虫菊酯化合物，如二氯苯醚菊酯、氯氰菊酯和溴氰菊酯。其中溴氰菊酯是一个单一的光学活性体，是目前为止所合成的除虫菊酯中活性最强的广谱杀虫剂。 1.2大豆乙酰酯酶 酯酶顾名思义是催化酯类化合物水解的酶系，它能催化羧酸酯类酯键的水解和合成，其中羧酸酯酶、芳香酯酶、乙酰酯酶等的底物特异性不强，酶分子多样性较普遍；另一些能水解较复杂的羧酸酯的酶，则底物特异性较强，如胆碱酯酶、胆固醇酯酶、乙酰胆碱酯酶、酯酶以及文生素 A酯酶。 目前，植物酯酶都是以粮食作物如小麦、荞麦、大豆、豌豆、玉米等为酶源。肖建军等[3]（2002）从小麦中提取植物酯酶，以农药乐果为抑制剂，采用分光光度法研究了乐果对各种小麦酯酶活性的影响；研究显示，不同品种小麦酯酶对农药乐果的敏感度不同，在所研究的品种中，豫麦 39 和小麦周 9 对乐果较敏感，研究结果说明了选择酶源的必要性。徐斐等[4](2003)在不同pH条件下对可被有机磷农药抑制的不同来源的植物酯酶迸行了筛选。温艳霞[5]等（2006）对陕西和河南主要种植的 5 种小麦以及水稻、黄豆、玉米、种子中的酯酶进行了筛选及提取方法研究。王亚飞等[6]（2011）分别测定了玉米、薏米、燕麦、面粉、大豆、小米、大米、苜蓿、锦鸡儿、羊草、三叶草、狗尾草、小叶章酯酶的总酯酶活力和比活力，发现大豆酯酶酶活力最强，苜蓿酯酶对农药的灵敏性最强。 1.3农药残留检测的研究进展 传统的农药残留检测法是气相色谱法[7~9]和高效液相色谱法[10~13]，此法操作复杂，仪器昂贵，不适用于快速检测。农药残留快速测技术的方法有：化学检测、生化检测和生物检测三大类，目前这三大类中研究较多的有免疫分析法、仪器分析法、活体检测法、生物传感器法、酶抑制法。本实验采用酶抑制法检测农药被菌株降解的情况，且酶抑制法中酶最为关键。 近年来有很多有关有机磷农药快速检测方法的研究其酶抑制法由于灵敏简便检测快速而得到广泛应用作为酶抑制法的生物识别元件的酶主要有 3 种：胆碱酯酶、有机磷水解酶和植物酯酶。由于植物酯酶材料易得、含量丰富且具有与胆碱酯酶和有机磷水解酶相似的检测限而受到重视。 近年来利用乙酰胆碱酯酶开展了很多农药快速检测的研究，但乙酰胆碱酯酶的提取产量低，成本高，不能满足当前农药残留检测的需求，而植物酯酶的成本大大低于乙酰胆碱酯酶，保质期也比较长，因此本文以大豆为材料，研究植物酯酶对农药的灵敏性。 1.4拟除虫菊酯微生物降解的研究进展 目前，可降解农药微生物的获得途径主要为：a）从受农药污染严重的土壤中取样，筛选和分离具有优良性状的菌株（一般是利用农药排污口及周围或长期使用某一种农药的土壤，经富集培养，分离出可降解农药的高效菌株）；b）诱变育种及构建工程菌株。 1）降解效果的发现： 埃及 Magdoub[14]等 1989 年和印度 Misra[15]等 1996 年研究乳酸菌对牛奶中氰戊菊酯的降解情况，发现牛奶中的氰戊菊酯被乳酸菌吸附并降解了，当在受氰戊菊酯污染的牛奶中接种乳酸菌，培养一段时间再检测其中的农药残留，发现农药残留量降低了，从而减少经济损失。印度 Rangaswamy[16]等研究也发现，从土壤中分离纯化得到的细菌也可以降解氯氰菊酯和氰戊菊酯。巴西 Musumeci[17]等研究表明，假单胞菌可以去除土壤呈结合态的残留氯氰菊酯。这种细菌在唯一 C 源为氯氰菊酯为的基础培养基中具有降解活性，但在普通培养基中丧失降解活性。 微生物是大自然中生物修复中的主体，对农药残留的降解起着至关重要的作用[18]。人们在研究农药降解微生物方面，人们已经取得了巨大的成就，发现了大量降解农药的微生物种类，同时深入了解降解机理，提高降解效率，稳定降解效果。目前国际上已分离出许多拟除虫菊酯类农药降解菌株，对菌株性质和生长条件等方面进行了深入研究。 2）菌株的分离、鉴定及生理生化特性研究： 美国 Lee[19]等从在受到污染的沉积物中，分离纯化出 56株降解拟除虫菊酯的菌株，其中6 株能够在水相中同时降解联苯菊酯和氯菊酯，而且也可以在沉积物中降解联苯菊酯。在水相中联苯菊酯被菌株Stenotrophomonas acidaminiphila迅速降解，半衰期由700 h以上降到30～131 h。接入降解菌后，顺式和反式氯菊酯半衰期缩短了近 10 倍。联苯菊酯在农田沉积物中半衰期为 343～466 h，但在河流沉积物中，半衰期增加到 980—1200 h。埃及Hashem[20]等在使用过拟除虫菊酯(氰戊菊酯、溴氰菊酯和氯氰菊酯)的土壤中，分离纯化出 8 株拟除虫菊酯类农药降解菌，经过鉴定，这 8 株菌株都属于芽孢杆菌属，拟除虫菊酯都可作为这些菌株的唯一 C 源。虞云龙等[21]从杭州农药厂废水排放口污泥中分离到 1株降解菌Alcaligenes sp． YFl 1，在试验条件下，菌量 OD415mm 为0．20时，该菌株对 50 mg/L 的氰戊菊酯、溴氰菊酯、三氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、氯菊酯的降解速率分别为 5．06、8．01、3．04、9．24、2．00、3．84 μmol／(L-h)，对对硫磷、甲基对硫磷、杀螟松的降解速率分别为 16．15、28．55、20．86μmol／(L．h)，对杀灭菊酯的降解为矿化作用。丁海涛等[22]分离到地衣芽孢杆菌 qw5菌株，培养 5天，对氰戊菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯的降解率分别为 53． 8％、 41． 2％和61． 7％。许育新等[23]分离到红球菌属 CDT3菌株，在摇瓶中3 天对100 mg／L的氯氰菊酯的降解率为84．24％，小区试验中对茶叶上氯氰菊酯的降解率达到 68．94％。王兆守等[24]从农药厂的下水道污泥中分离出能以拟除虫菊酯类农药为唯一 c 源和能源的降解菌阴沟肠杆菌 w10i15。在30℃、pH7．0基础培养基发酵液中，该菌 3天对100 mg／L的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的降解率分别为 52．43％、50．76％和56．89％。经紫外线诱变后，正突变菌株 UWl9 对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解率比出发菌株降解率提高了近 20％；UW2 也比出发菌株提高了约 10％的降解率[25]。 3）降解途径的研究 目前已报道的仅虞云龙等[26]采用 GC-MS 检测到降解菌 Alcaligenes sp.YF11 对杀灭菊酯的 2 种降解产物，通过这2种产物推导了降解菌 Alcaligenes sp.YF11对杀灭菊酯的可能降解途径，但研究没有涉及到参与降解过程的相关酶及影响降解的关键酶。 Yingxiao等人从活性污泥中分离出一种能高效降解 β-CP 的新型细菌菌株BSF01，并鉴定其为枯草芽孢杆菌；并在代谢物的分析的基础上提出了一种新颖的 β-CP 生物降解途径。 1.5本实验研究的方法和内容 1.1.5 本实验研究方法： 1.5.1.1 双水相萃取纯化大豆乙酰酯酶 1.5.1.1.1 双水相萃取纯化大豆乙酰酯酶的原理 双水相萃取技术分离大豆乙酰酯酶的原理主要是根据被分离组分在双水相体系两个相 中的分配性能的差异，通过组分在两相中的一次或多次分配，实现组分的分离和提纯。常用的双水相体系：聚乙二醇/无机盐体系和聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（dextran）体系。 双水相萃取法主要适用于生物大分子物质的提取和细胞碎片的分离除去。生物大分子物质在有机溶剂中容易变形失活，通常不适于有机溶剂萃取法进行提取，但是在含水量很高的两水相系统中，能保持其天然的空间构型，不易失活，故可以达到很高的收率。双水相能直接将细胞内物质从细胞破碎后的匀浆液中分离出来，由于胞内产物经细胞破碎后的细胞碎片很细小，分离除去细胞碎片长期以来是提取过程中的一个难点。细胞匀浆液经双水相萃取后可使目标产物分配在上相，而细胞碎片分配在下相，从而容易得将其分离出去。因此，双水相萃取技术给胞内物质的提取提供了一条有效途径。 双水相萃取法具有如下优点：1）传质速度快。2）容易放大，分配系数重演性好。3）不容易使生物大分子物质破坏，收率高。4）浓缩倍数和处理容量大，能耗低。 1.5.1.1.2 双水相萃取技术在酶及蛋白分离中的应用 双水相技术广泛应用于生物大分子物质的分离和纯化，如氨基酸、多肽、核酸、各类细胞、病毒等，特别是成功的应用在蛋白质的大规模分离当中。某些廉价的无机盐与聚合物构成的分离性能良好的双水相体系代替了昂贵的 Dextran 与PEG组成的双水相体系。