1.3 MDA和H2O2的测定
参照Han et al. (2008) 和 Jin et al. (2013) 的方法,通过测定硫代巴比妥酸活性物质(TBARS)的含量来判断膜脂过氧化的程度。取0.5 g叶片加入5mL 5%(w/v)TCA充分研磨,1,2000×g 离心15 min;取2 mL上清液,加入2 mL0.67% 硫代巴比妥酸(10%TCA配置),加热至95℃反应30min,冰浴迅速结束反应,1,2000×g 离心10 min,分别在450 nm、532 nm、600 nm 测定反应液的吸收值,根据公式计算MDA含量:MDA(nmol g-1 FW) = [6.45×(A532-A600)]-[0.56×A450].
按照Velikova et al. (2000)的方法,测定对照叶片及铝胁迫处理后叶片中 H2O2 的含量。取0.2 g叶片加入2 mL0.1%(w/v)TCA,在冰盒上研磨成匀浆,12,000×g离心15 min;取0.5 mL上清液,加入0.5 mL 10 mM(pH7.0)磷酸缓冲液和 1 mL KI,完全反应后,在390 nm波长下测定反应液的紫外吸收值;再根据已知浓度的H2O2曲线计算出相应H2O2浓度。
1.4 SOD,CAT,APX,GR,POD抗氧化酶活性的测定
取0.5 g叶片液氮研磨,加入3 mL 50 mM(pH 7.0)磷酸缓冲液(含1mM EDTA 和1%聚乙烯吡咯烷酮)研磨成匀浆,在4℃条件下1,2000×g 离心20 min之后,取上清液用于各种酶活性的测定。
按照 Giannopolitis和Ries(1977)的方法,通过测定氮蓝四唑光化学还原的抑制程度来分析SOD的活性。其中3mL反应体系包括:50 nM(pH 7.8)磷酸缓冲液,13 mM甲硫氨酸,75nM NBT,2 nM核黄素,0.1 mM EDTA和100μL酶提取液;反应混合液在1000 µmol m-2s-1光强下照射15 min后结束反应。一个SOD活力单位以560 nm波长下,抑制 50% NBT光还原所需的酶量计算。
按照Aebi(1984)的方法,通过测定240 nm波长下3 min内H2O2的消耗量计算CAT(消光系数为39.4 mM-1cm-1)的活性,3 mL反应体系包括:50 mM(pH7.0)磷酸缓冲液,10 mM H2O2,100 µL酶提取液。
根据Nakano和Asada(1981)的方法,通过测定290 nm波长下3 min内反应体系紫外吸收值的下降计算APX(消光系数为2.8 mM-1cm-1)的活性,3 mL反应体系包括:50 mM(pH 7.0)磷酸缓冲液,0.5 mM ASC,0.1 mM H2O2,50 µL酶提取液。以添加酶提取液开始反应。
按照朱展才(1986)的方法,通过测定470 nm波长下3 min内吸光度变化值即愈创木酚的氧化程度计算 POD的活性,3 mL反应体系包括:100 mM(pH 5.4)醋酸缓冲液,0.25%愈创木酚,0.75% H2O2,10 µL 酶提取液。
按照Schaedle和Bassham(1977)的方法,通过测定340 nm波长下3 min内NADPH的氧化程度计算GR(消光系数为6.2 mM-1cm-1)的活性,3 mL反应体系包括:50 mM(pH 7.8)磷酸缓冲液,2 mM Na2EDTA,0.15mM NADPH,0.5mM GSSG,150 µL酶提取液,反应从加入NADPH开始。
1.5叶片光合气体交换参数的测定
天气晴朗时,在上午9:00-11:30利用便携式光合作用分析仪(Li-6400, Li-Cor,USA)测定第四叶光合气体交换参数,测定时采用红蓝光源叶室,设置光强为1800 µmol m-2s-1,叶室内温度设置为25℃,CO2浓度为400±10 µmol ml-1,空气相对湿度为70±5%。测定光合参数Pn(净光合速率),gs(气孔导度),Ci(胞间CO2浓度)和Tr(蒸腾速率)。
CO2响应曲线测定时的CO2浓度梯度设定为400、200、150、100、75、50、400、400、800、1200、1500、1800 µmol mol−1;光响应曲线测定时的光强梯度设定为 2000、1800、1200、800、400、200、100、50、20、0 µmolm-2 s-1;CO2响应曲线及光合响应曲线参照。光呼吸速率(Rd),光补偿点(Lcp),光饱和点(Lsp),表观量子传递速率(AQE),和最大净光合速率(Pmax) 被计算通过光响应模型曲线,一个非等轴双曲线。
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