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5 30 5 3 0 1 500 5/10 0 20
6 30 5 0 10 20 500 1/2 0 5
7 30 5 0 0 1 200 1/2 24 20
8 30 1 0 0 20 500 5/10 24 5
9 10 5 3 0 20 500 5/10 0 5
10 10 1 3 0 20 500 1/2 24 20
11 30 1 3 10 1 500 5/10 24 5
12 10 1 0 10 1 500 5/10 0 20
3.3相应面实验设计
为了提高试验的可靠性，根据单因素试验和PB 筛选的3个显著因素：震荡次数、超声时间、加入提取液量进行响应面优化，共17组试验，以辅酶含量为响应值，确定酵母细胞内辅因子NAD+、NADH提取得率的最佳工艺参数，试验设计如表3-2所示。
表3-2 响应面试验方案
Table 3-2 Analysis of response surface analysis
序号 震荡次数（次） 超声时间（min） 加入提取液量（mL） 辅酶含量（umol/L）
1 10 10.5 5 0.71
2 5 10.5 3 1.21
3 5 1.0 5 1.57
4 10 20 3 1.41
5 5 20 1 1.4
6 0 10.5 5 2.04
7 0 10.5 1 1.18
8 10 10.5 1 0.92
9 0 20 3 1.17
10 5 10.5 3 1.45
11 5 10.5 3 0.41
12 0 1 3 1.47
13 5 20 5 2.07
14 5 1 1 2.15
15 5 10.5 3 2.2
16 5 10.5 3 2.1
17 10 1 3 2.14
3.4 NAD+/NADH检测条件优化
3.4.1 高效液相色谱法
一个好的分析方法必须满足以下要求：①特异性和专一性强，②灵敏度高，并且较稳定，③手续简便易行，④准确度好，⑤重现性好。而选择一个特异、有效的检测指标是建立分析检测方法的前提。检测酵母细胞内辅酶NADH/NAD+的关键步骤为:胞内辅酶的高效提取及辅酶含量的准确测。NAD+因其极性较弱而易保留在疏水性强的色谱柱中,致使其被洗脱的时间较长,峰形展宽,分离不够理想。当在洗脱液中加入带正电荷的配对离子四丁基氢氧化铵后, NAD+等化合物中带负电荷的部位便与之结合,致使整个化合物分子 所带的电荷减少,极性减弱。由于NAD+与配对离子结合后其极性减弱相对地较少,而其它辅酶的极性减弱较多,所以NAD+先被洗脱。此外,由于在洗脱液中增加了弱极性的有机溶剂的比例,各化合物的出峰时间均提前,从而缩短了样品的总分析时间。NADH在紫外260nm处有主吸收峰，在340nm有其特征吸收峰。其激发光谱和发射光谱波段分别为340nm和460nm，因此，紫外吸收光谱，特别是A340可作为检测和分析NADH的主要指标，因为NADH在紫外340nm有独特的吸收峰，而其类似物NAD以及其它许多胞内蛋白、核酸等物质在340nm处没有吸收特征吸收峰，所以A260和A340也是估计NADH纯度的重要指标。高效液相色谱(HPLC)具有高的灵敏度和准确度，且能进行有效的分离，灵敏度高，分离效果好。