乙醛脱氢酶提取工艺研究(2)

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2.2.3乙醛脱氢酶活性测定 9

2.2.4 蛋白浓度的检测 10

2.2.5 酵母细胞菌悬液的制备 11

2.2.6 超声波破碎提取ALDH的单因素实验 11

2.2.6.1 不同料液比对酶活力的影响 12

2.2.6.2 酶活力受缓冲液pH值的影响 12

2.2.6.3超声功率对酶活力的影响 12

2.2.6.4总超声时间对酶活力的影响 12

2.2.7超声波破碎因素正交分析 12

2.2.8最佳工艺条件验证实验 12

2.3 ALDH的提取与纯化 13

2.3.1硫酸铵沉淀法 13

2.3.2双水相法 13

3.结果与讨论 14

3.1 超声提取单因素实验结果 14

3.1.1 料液比对酶活力影响的结果 14

3.1.2 缓冲液pH值对酶提取影响 14

3.1.3 超声功率对酶提取影响 15

3.1.4 超声提取正交实验的结果 16

3.1.5最佳工艺条件的验证 16

3.2硫酸铵沉淀法分离纯化ALDH的结果 17

3.3双水相法分离纯化ALDH的结果 17

4.结论与展望 18

4.1结论 18

4.2展望 18

致谢 19

参考文献 20

1.绪论

1.1 乙醛脱氢酶的概述

乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase,ALDH)是一类氧化各式各样脂肪族醛、芳香族醛为相应酸的酶，广泛存在于细菌、植物、动物和昆虫中，在辅酶I存在的条件下，它能催化某些醛和酮的脱氢反应。在人体内及其很多动物体内，线粒体内的乙醛脱氢酶能转化生物体有害的醛类，因此在细胞解毒研究中，乙醛脱氢酶备受人们的关注。乙醇进入人体内后，主要是在肝脏内进行代谢。乙醇代谢主要靠两种酶，一种是乙醛脱氢酶（ADH），另一种是乙醛脱氢酶（ALDH）。乙醛脱氢酶（ADH）是一种含锌酶类，它能够以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为辅酶，催化伯醇和醛之间的可逆反应。乙醛脱氢酶的主要作用是将乙醇转化为乙醛，在酒精代谢中起主要作用。已知人类的乙醛脱氢酶由三个基因所编码：ALDH1A1、ALDH2及21世纪初发现的ALDH1B1（亦称ALDH5）。乙醛是一种毒性很强的物质，可以共价结合微粒体蛋白形成乙醛蛋白络合物，抑制干细胞合成蛋白的排出，最终造成人体酒精性肝病的发生。除此之外，乙醛还能通过黄嘌呤氧化酶转变成超氧化合物，使膜脂质过氧化生成丙二醛和壬烯，它们进一步促进了干细胞释放因子，最终破坏细胞膜。当人体内乙醛含量积累过多时，会产生脸红、呕吐等现象，严重时会导致休克。因此，乙醛脱氢酶分解乙醛受到了人们的重视，希望通过研究乙醛脱氢酶来研发出解酒的制品，加快体内乙醛的代谢。源[自-751^`论/文'网·www.751com.cn

1.1.1乙醛脱氢酶的分类

乙醛脱氢酶由三个基因所编码：ALDH1A1、ALDH2及21世纪初发现的ALDH1B1（亦称ALDH5）。人类ALDH是一种由四个亚基形成的四聚体，每个亚基的相对分子质量约为56kDa。在已发现的ALDH同工酶中，常见为 ALDHl、ALDH2、ALDH3、ALDH4 四种，ALDH2对乙醛亲和力较高，是体内催化乙醛氧化的主要酶蛋白。目前的遗传学研究表明，ALDH 中只有 ALDH2 表现出遗传的多样性。在人群中，由于ALDH2基因的一个位点出现碱基置换的突变，鸟嘌呤被置换成了腺嘌呤而失去活性。所以ALDH2有ALDH2*I和ALDH2*2这两个类型的等位基因。所以该基因型的组合方式有，第一种的基因型为ALDH2*I／*I，产生的酶蛋白具有比较高催化能力；第二种的基因型为ALDH2*I／*2，产生的酶蛋白催化能力有所下降，仅为第一种基因型所产酶活性的0.16倍左右；第三种基因型为ALDH2*2／*2，产生的酶蛋白基本完全丧失了催化活性[1]。复旦大学李青松[2]等研究在昆虫细胞表达系统中表达ALDH2 *I和ALDH2*2这两种基因型，并分别检测两种基因型表达的酶蛋白的催化活性。结果发现ALDH2*2表达的酶蛋白的活性显著低于ALDH2 *I表达的酶蛋白对乙醛的催化活性。验证了ALDH2*2在体内表达的酶活性的缺失。截至2012年，对前种乙醛脱氢酶进行了广泛的研究，并发现其有效促使短链脂肪族醛和芳香族醛的氧化。相比较之下对第三类乙醛脱氢酶的研究较少特别是对微粒体乙醛脱氢酶的研究，大鼠肝脏、兔子肠道、人类肝脏和人白血细胞中都发现了微粒体乙醛脱氢酶的存在，但作用机制尚不明确。