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摘要： 基于组氨酸和Ni2+的特异性结合作用，我们设计合成了一种简单方便的指示剂置换法用于人体尿液中组氨酸的测定。在纯水溶液中,以紫脲酸铵作为指示剂，通过荧光光谱定量检测组氨酸。将组氨酸引入到紫脲酸铵-镍离子体系中，由于组氨酸和紫脲酸铵对镍离子的竞争结合作用，会使溶液颜色和荧光信号均发生变化，基于荧光信号的变化，可以实现对组氨酸的高灵敏和高选择性的检测。通过本方法建立一种无需复杂样品处理，简便、快速和灵敏的生物体液中组氨酸的测定方法。通过荧光光谱对识别的过程进行研究，确定了紫脲酸铵与Ni2+的配位比为2.5:6，Ni2+与His的配位比为1:1；组氨酸的线性范围为 2～70 µM。 51464
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毕业论文关键词： 组氨酸、镍离子、荧光、实际样品、紫脲酸铵、缓冲溶液、指示剂置换法、金属离子溶液
An Indicator displacement method for the determination of histidine Fang yuxi Adviser: Zhao Wenfeng Abstract: A simple and convenient indicator displacement method for the detection of histidine in human urine was developed based on an indicator-displacement assay and the histidine–Ni2+ affinity pair. In this method, murexide was used as the indicator and the alternative detection of histidine was achieved based on the competition between histidine and murexide for the binding with Ni2+. The competition of histidine with indicator for Ni2+ resulted in an apparent color change of the solution from yellow to red purple, The developed method allows the sensitive, selective and rapid detection of histidine in human urine samples. The detection limit was 0.06 µM with a linear range from 2 to 70 µM. The method was successfully used to the determination of histidine in biological fluids samples with recoveries from 91.40% to 99.69%.
Keywords: Histidine; Nickel ions; Fluorescence; Actual samples; Murexide; Buffer solution; Indicator displacement method; Metal ion solution
1 前言 组氨酸是蛋白质组成中的一种碱性氨基酸，测定它对于营养学和遗传代谢等方面的研究具有实际的意义[1]。许多分析方法都被用来检测组氨酸，包括高效液相色谱法[2-3]、偶氮反应、电化学法、电泳分离法、流动注射分析法、比色法[4-7]、荧光法[8-11]等等。但是这些方法所花费的成本相对较大。而指示剂置换法是首先要使一种指示剂和它的受体进行可逆作用，然后引入具有竞争性的目标物，通过受体分子与目标物之间的相互作用，而这种作用要比受体和指示剂之间发生的可逆作用强，因此可以将指示剂竞争下来，而指示剂置换法常伴有指示剂光学信号的变化，从而可以对目标物进行分析检测。[12] 因为指示剂置换法简单方便，所以选择它用于测定组氨酸。[13-16]在这里，我们选用紫脲酸铵作为指示剂，通过紫脲酸铵与组氨酸对 Ni2+的竞争性结合作用，以实现对于组氨酸的测定。此实验中，我们系统性地优化了影响此方法检测效果的各种可能因素，并将其运用于检测人尿中组氨酸的含量。 2 实验部分 2.1仪器及试剂 F-4600 荧光分光光谱仪；pH510 酸度计；精密电子天平；超声波清洗机；纯水仪。 紫脲酸铵；氯化铵缓冲溶液；组氨酸，实际样品（人体尿液）；各种金属离子溶液；源`自,751.文;论"文'网[www.751com.cn NEM试剂。 2.2荧光检测 本实验中采用 F-4600 荧光分光光谱仪，在 350 nm-650 nm 范围内对待测液进行测定。待测溶液的体积为10 mL。 2.3溶液的配制 紫脲酸铵溶液：称取0.0284 g紫脲酸铵溶解于 100 mL容量瓶中（现配现用）。
Ni2+溶液：称取 0.0129 g固体溶于 100 mL容量瓶中，得浓度为 1 mM 的Ni2+溶液。 组氨酸溶液：称取 0.0015 g His 于10 mL塑料管中，加入10 mL超纯水溶解，得浓度为1 mM 的组氨酸溶液（现配现用）。 NEM溶液：称取 0.0125 g N-乙基马来酰亚胺溶于100 mL容量瓶中，配成 1 mM 的NEM溶液。 所有玻璃器皿在使用前均用新鲜王水进行清洗。 2.4干扰离子实验 本实验中选用的干扰离子溶液有 CuCl2· 2H2O、Al2(SO4)3· 18H2O、BaCl2· 2H2O、CaCl2、CdCl2· 5/2 H2O、FeCl2· 4H2O、KCl、MnCl2· 4H2O、Pb(NO3)2、SnCl2· 2H2O、Zn(NO3)2· 6H2O、CoCl2· 6H2O、AgNO3。以上13种金属离子溶液均为1 mM，将其分别加入待测液中再测量荧光强度。 2.5实际样品 在 100 µL人体尿液中加入 100 µL 1 mM NEM 试剂，室温下反应 20分钟后，加超纯水定容至10 mL（即稀释 100倍），作为实际样品。在含有 Ni2+和紫脲酸铵的 pH 8.5 的氯化铵缓冲溶液体系中加入实际样品，检测其荧光强度，发现此时尿液中的组氨酸对体系不存在影响。在此基础上再加入不同浓度的组氨酸，检测其荧光强度。 3 实验过程 为了考察紫脲酸铵和 Ni2+之间的相互作用，我们做了以下的实验：在 14 个10 mL标准离心管中依次加入 25 µM 紫脲酸铵溶液（紫红色溶液）和 10 µM 氯化铵缓冲溶液（pH8.5），再分别加入 0 µM、2 µM、5 µM、9 µM、10 µM、20 µM、30 µM、40 µM、50 µM、60 µM、70 µM、80 µM、90 µM、100 µM 的 Ni2+溶液，发现待测溶液由紫红色逐渐变为黄色，加超纯水至 10 mL，测定其荧光强度。