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2.2.1 实验流程 11
2.2.2 PCR基本原理 12
2.2.3 DNA酶切反应基本原理 12
2.2.4 DNA酶连反应基本原理 12
2.2.5 基础实验操作 12
3 结果 15
3.1质粒构建 15
3.2 引物设计 15
3.3 PCR扩增目的基因 15
3.3.1 PCR扩增目的基因EmrE 15
3.3.2 PCR扩增目的片段ΔspΔspMBP和ApoAI* 16
3.4 酶切反应 17
3.5分子克隆 18
3.5.1第一步克隆 18
3.5.2第二步克隆 20
3.5.3第三步克隆 21
3.6 预表达 23
3.6.1小量表达收集细胞 23
3.6.2细胞破碎及纯化 24
4讨论 25
结 论 27
致 谢 28
参 考 文 献 29
1 绪论
膜蛋白在细胞的生理活动中扮演着重要的角色，它在药物研发和疾病治疗方面具有重大的作用，对其进行功能和结构研究的需求非常迫切，但是，膜蛋白的研究存在着很大的瓶颈，膜蛋白的丰度低，很难从天然生物体中提取，而且大多数膜蛋白是不溶于水的，很多研究通过寻找合适的去污剂溶解膜蛋白，虽然有了很大的进展，但是，膜蛋白和去污剂相互作用具有特殊性，寻找合适的去污剂，需要大量的财力和人力，耗费成本非常大，所以获得大量可溶性的膜蛋白是必须攻克的一大难题。我们试图通过构建融合蛋白，采用融合表达技术获得大量的膜蛋白，经过查阅文献和寻找资料，我们发现内膜蛋白和二元增溶蛋白融合后的溶解性并没有得到很大的提高，不能保证我们对其进行功能和结构的研究，鉴于这个问题，我们设想构建一个三元融合体，设想将目的膜蛋白放在两个增溶蛋白的中间，从而提高它的产量和溶解性。
1.1 生物膜和膜蛋白
生物膜是由糖类，两性脂类和蛋白质组成，其厚度一般为4~5nm。生物膜在细胞基础生理过程中具有极其重要的作用。首先，它是一种选择性透过薄膜，将细胞内和细胞外的环境隔离开，为细胞的各种生命活动提供了相对稳定的环境，其次，它还具有特定的识别位点，便于细胞内外信息的传递，最后，生物膜还有利于物质运输，能量转换和神经传导等生理过程。一般地，我们认为生物膜具有流动性和不对称性，因为生物膜独特的排列方式，它的疏水性尾部相对，亲水性头朝外，形成磷脂双分子层，蛋白质分子会横跨或着黏附在磷脂双分子层上，所以表现出不对称性