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摘 要：本论文利用G-四链体特异结合荧光染料做信号输出，构建了一种非标荧光方法检测核酸外切酶。DNA探针自杂交形成发夹结构，封闭G-四链体序列。核酸外切酶III（Exo III）酶切发夹探针，释放G-四链体，嵌入荧光染料NMM后荧光显著增强，从而实现对Exo III活性的检测。该方法操作简便、快速灵敏，无需复杂的序列设计和荧光基团标记，可应用于Exo III活性的实时检测。31455
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毕业论文关键词：G-四链体；DNA发夹探针；核酸外切酶III；荧光染料
A G-quadruplex-based DNA Hairpin Probe for Fluorescence Detection of Exonuclease Activity
Abstract：In this paper，we developed a label-free fluorescent method for detection of exonuclease activity by taking the specific interaction between G-quadruplex and its fluorescent ligand as signal readout．The DNA probe can form a hairpin-shaped structure by self-hybridization，and block the formation of G-quadruplex．The digestion of hairpin probe（HP）by exonuclease III（Exo III）leads to the release of free G-quadruplex sequence．After interacting with NMM，a sharp increase in fluorescence intensity can be obtained then the detection of Exo III activity should be realized．The proposed method is easy to use，rapid and sensitive，and avoids the requirement for complicated design and fluorophore-labels，which can also be applied for the real-time assay for the Exo III activity．
Key Words：G-quadruplex；DNA hairpin probe；Exonuclease III；Flourescent dye
目 录
摘 要 1
引 言 1
1 实验部分 3
1.1 实验仪器 3
1.2 实验药品和试剂 3
1.3 实验步骤 3
2 结果与讨论 3
2.1 实验原理与DNA探针设计 3
2.2 实验原理验证 4
2.3 实验条件考察 5
2.4核酸外切酶活性的检测性能 6
3 结 论 7
参考文献 8
致 谢 11
基于G-四链体的核酸发夹探针荧光检测核酸外切酶
引 言
核酸外切酶属于DNA降解酶，是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3、5-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸。按作用的特性差异可以将其分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。大肠杆菌核酸外切酶III（Exo III）具有多种催化功能，可以降解双链DNA分子中的许多类型的磷酸二酯键。其中主要的催化活性是催化双链DNA按3'→5'的方向从3'-OH末端释放5'-单核苷酸。Exo III 通过其3'→5'外切酶活性使双链DNA分子产生出单链区，经过这种修饰的DNA再配合使用Klenow酶，同时加进带放射性同位素的核苷酸，便可以制备特异性的放射性探针。核酸外切酶在一些重要的细胞和生理过程中扮演重要的角色，如双链DNA断裂的修复[1]，促进基因重组[2]和预防基因组不稳定[3]。因此，核酸外切酶活性的检测对疾病诊断和药物发展有重要意义。传统的检测核酸外切酶活性的方法通常是基于凝胶或需要使用放射性同位素标记的DNA[4-6]。然而，这些方法成本高，操作不便又繁琐耗时，并且需要必要的安全措施来控制射线曝光。近期，一些新型检测方法如荧光传感方法屡见报道。例如张等发展了一种基于双链DNA为模板合成铜纳米颗粒做荧光探针检测核酸外切酶的活性[7]。
G-四链体是由具有连续G序列的DNA或RNA形成的一种特殊的核酸二级结构，它是由四个鸟嘌呤碱基G通过Hoogsteen氢键的配对方式首尾连接构成平面的G-四分体，相邻的G-四分体平面之间又通过π-π堆积作用而形成的[8]。由于有望形成G-四链体机构的序列广泛地分布于人类基因组的许多重要区域[9-16]，尤其是染色体末端的端粒区域[17-19]，有关G-四链体的研究已经成为国际上的一个研究热点。阳离子对G-四链体的形成及稳定性有明显的促进作用。由于K+在诱导G-四链体机构形成及稳定G-四链体方面所表现出来的能力要明显强于Na+，近几年来，人们就G-四链体在K+检测方面的应用开展了一系列探索性的工作，并取得了令人瞩目的成果。非标记荧光检测法凭借快速方便、灵敏度高等优点，已经引起越来越多的研究者的关注。N-甲基卟啉IX（NMM）具有不对称阴离子卟啉特征，对于G-四链体序列有显著的结构选择性，而对双链DNA、RNA和RNA-DNA杂交体或寡核苷酸的结合力较弱[20]。NMM在溶液中本身的荧光较弱，但是特异性嵌入G-四链体结构后，它的荧光显著增强，从而可以做信号输出发展一系列荧光传感器[21]。例如，胡等利用G-四链体嵌入NMM做信号输出构建了一种非标功能化的分子信标荧光增强型检测DNA和核酸酶[22]。赵等基于DNA连接反应和G-四链体结构发展了一种非标荧光DNA探针检测辅酶[23]。另外DNA二级结构G四链体可能是药物设计的新的合适靶点[24]。
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