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1.2.1定量相位显微方法（1）傅里叶相位显微法（FPM）G.Popescu等采用傅里叶相位显微法（FPM）[4]，将透过细胞的散射光和非散射光干涉，通过傅里叶频谱面上相位调制实现四步移相，具有提取定量相位图像的特征，并且在几秒到一个细胞生命周期内具有亚纳米级的光程灵敏度。该方法是基于把定场分解为平均场和空间变化场的原理发展而来。其特点为：1.干涉臂经过了相同光程（即具有共传输路径的特点）使系统具有高度稳定性。2.干涉场由显微镜的输出图像进行傅里叶变换之后得到，进一步缩小了干涉场的光程，提高了横向分辨率和机械稳定性。3.采用低相干光源，经不同器件多次反射产生的条纹得到抑制，提高了系统的灵敏度。Gabriel Popescu 等利用FPM分解低相干光学图像, 得到了如图1-2(a)所示的红细胞间接核分裂期间色码定量相位图,空灵敏度达到了波长的 1/5000, 且稳定时间达到了几个小时, 有利于定量分析细胞动力学, 如形状变化或增长分裂。图1-2(b)所示的为伪彩色显示定量相形象全血涂片, 复原了圆盘状的红细胞。考虑到血红蛋白折射率, 可以提供红细胞信息。加入一种高通量的程序可以筛选各种异常红细胞和潜在其他血液成分。Niyom Lue 等发展了快速傅里叶相显微镜(f-FPM) , 采集率提高百倍以上。横向分辨率和路径长度达到了2 nm 和10 frame/ s 以上, 为研究活细胞的结构和动力学拓宽了方法, 证明了用数字化的振幅和相位信息研究亚细胞结构的可行性。10026
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图1-1 FPM 基本光路
图1-2 403 显微镜下 FPM 图像。(a) 未分裂的海拉细胞的相位图, ( b) 全血图片的相位图
（2）希尔伯特相位显微( HPM)
希尔伯特相位显微( HPM) 是对 FPM 的一种补充 。这种技术把在时域中用复数分析信号的概念推广到空间域中, 并只从记录的一张空间干涉图中测出定量的相位图。希尔伯特相位显微技术可以得到相位物体的定量相位图像。此外，该技术可以测量相位轮廓远远大于照明灯光波长的相位物体。上述重要特征源于加在图像上的高空间调制，其在相位图上产生了明确的交迭点有助于解包。希尔伯特相位显微法单次拍摄就可以获得定量相位图，因此就可测量动态物体。由于其单次拍摄特性, HPM 的识别时间只受记录设备 CCD 的限制, 因此可用于毫秒级时间内定量出纳米级的光程变化。希尔伯特相位显微技术是测量例如活细胞的动态过程的相位物体快速现象的有力工具。
图1-3 HPM基本光路
Takahiro Ikeda 等利用 HPM 技术还原出血涂片上红细胞, 分辨率达到了 5 um，并且检测微米级别的液滴的蒸发现象，显示出液滴在蒸发的过程中形状上的变化。Gabriel Popescu等 利用 HPM 技术测量溶血细胞内血红蛋白的流出过程, 在毫秒量级上达到了亚细胞水平的空间灵敏度。图1-4 选取了 2个发生溶血现象的红细胞, 在10 s 的过程中, 细胞动态厚度剖面在2 个观测方位上的厚度变化情况可由相位测量实时测出。
图1-4 红细胞形体变化的定量分析。( b) 和(d)分别是从( a)和( c)上标注的箭头方向测量的结果
（3）衍射相位显微( DPM)
衍射相位显微( DPM) 结合了FPM的共几何路径干涉和 HPM 的单次拍摄特性，因此定量相位图在亚纳米级光程上具有固有的稳定性，并且其获取速度只有毫秒级，只决定于探测器的记录速度。
用 Nd:YAG 激光器激光的二级谐波作为倒置显微镜的照明光，在输出端得到样品放大的像。这个显微图像就像是被虚拟源照射的一样。传递镜头 RL 用于对 VPS 产生出来的光进行准直，并把显微图像重现到屏 IP 上。相栅 G置于 IP 上, 使之产生包含图像全部空间信息的多级衍射。用 L1-L2 标准空间滤光透镜系统筛选出零级和 1 级衍射级，分别作为样品光场和参考光场。零级衍射光束通过置于 L1 的傅里叶平面上的空间滤光器 SF 进行低通滤光，使得到的 CCD 屏上的光场近似为均匀场，空间滤光器允许全部的1 级衍射光频率信息通过，而阻止其他级。在 CCD屏上得到最终的干涉图。两光束经过了相同的光学路径，因而大大地减低了纵向相位噪声。