甲烷氧化菌B22培养条件及代谢产物初步分析(3)

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而本实验由甲烷氧化菌的正常代谢途径最后变成二氧化碳出发，主要探究甲烷氧化菌的生长条件及其在醇中的代谢产物初步分析。完成了对甲烷氧化菌B22培养条件及其在甲醇、乙醇作为底物是的生长情况和代谢产物的初步分析，以考察该菌在甲烷转化中的作用。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种

甲烷氧化菌（Methanotrophic bacteria,methanotrophs，编号为B22），保存于中国科学院天津工业生物技术研究所。

2.1.2 实验所用培养基

NMS培养基：硝酸钾1 g/ L、十二水磷酸氢二钠0.717 g/ L、磷酸二氢钾0.272 g/ L、乙二胺四乙酸钠(EDTA）0.05 g/ L、六水氯化钙0.2 g/ L、七水硫酸镁1 g/ L、微量元素1 mL/ L。（注意：进行高温灭菌时，因为高温情况下会使六水氯化钙和七水硫酸镁产生沉淀，所以两者必须单独进行灭菌；微量元素在培养基灭菌冷却之后再加入，微量元素用铝箔纸包好4 ℃冰箱保存）。

调 pH所用NMS培养基：TRIS、HEPES、MES均为1 mM/ L（根据相对分子质量换算，三者相对分子质量为121.14, 238.3, 213.2）、硝酸钾1 g/ L、十二水磷酸氢二钠0.717 g/ L、磷酸二氢钾0.272 g/ L、乙二胺四乙酸钠（EDTA）0.05 g/ L、六水氯化钙0.2 g/ L、七水硫酸镁1 g/ L、微量元素1 mL/ L。

微量元素溶液：CoCl2•6H2O 0.1 mg/ L、MnCl2•4H2O 0.425 mg/ L、ZnCl2 0.05 mg/ L、NiCl2•6H2O 0.01 mg/ L、CuSO4•5H2O 0.015 mg/ L、Na2MoO4•2H2O 0.01mg/ L、Na2SeO4•2H2O 0.01 mg/ L（微量元素溶液需用铝箔纸保护在4 ℃冰箱保存）。

维生素复合物溶液：硫胺素B1 20 mg/ mL、对氨基苯甲酸 20 mg/ mL、烟酸 40 mg/ mL、吡哆素VB6 40 mg/ mL、核黄素 40 mg/ mL、泛酸钙 40 mg/ mL、VB12 5 mg/ mL、生物素 2 mg/ mL（注意：泛酸钙、VB12、生物素三种物质单独溶解，维生素复合物也不能通过高温灭菌所以采用过滤除菌的方式）。

LB培养基：氯化钠5 g/ L、酵母膏5 g/ L、胰蛋白胨10 g/ L。若要用固体LB培养基，则按1 g/ L再加入琼脂。来.自/751·论|文-网·www.751com.cn/

2.1.3 实验所用试剂

甲醇、乙醇、硝酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸钠、六水氯化钙七水硫酸镁、蛋白胨、氯化铵、酵母膏、柠檬酸铵、柠檬酸铁铵、尿素、硫酸铵氯化钠、甘氨酸（G Lycine）、甲酸、乙酸、甲酰胺、硫胺素（B1）、对氨基苯甲酸、烟酸、吡哆酸（VB6）、核黄素、泛酸钙、生物素（维生素H）、TRIS、HEPES、MES、琼脂糖、Ampici L Lin、IPTG、X-Galplates、Trans 2K DNA marker TIAN amp bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒Promega细菌连接T载体试剂盒。